Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia

Influência da microbiota intestinal nas propriedades imunológicas de uma vacina recombinante

Fri, 01 Jan 2016 00:00:00 GMT

Influência da microbiota intestinal nas propriedades imunológicas de uma vacina recombinante Chissoca, António Ribeiro Chissululo A microbiota humana é o conjunto de microrganismos que habitam as superfícies externas e internas do nosso corpo, tais como, pele, mucosa oral e respiratória, ou o trato gastrointestinal (TGI) e geniturinário (TGU). Este conjunto de microrganismos é adquirido pelos recém-nascidos inicialmente no momento do parto. Entre os 18 e 24 meses se torna já semelhante à microbiota de um adulto. Uma das principais funções dessa microbiota é a estimulação do sistema imune, tornando-o apto a desenvolver suas funções de homeostase e defesa, através do amplo leque de células e moléculas que o compõe. Existem evidências de que variações na microbiota intestinal podem causar alterações no sistema imunológico, podendo constituir um ambiente que modula de forma negativa ou positiva a indução de uma resposta imune eficaz. O desequilíbrio dessa microbiota (disbiose) pode provocar não só dano tecidual, mas também anergia imune, tolerização ou inflamação intestinal crônica que, caso persistam, podem comprometer a resposta do hospedeiro aos antígenos, e dentre eles àqueles que formam parte das vacinas. O presente trabalho teve como objetivo geral estudar o impacto das alterações provocadas experimentalmente na microbiota intestinal sobre a resposta imune de camundongos imunizados. Os animais foram vacinados por via subcutânea com 108 ufp/animal (109 ufp/mL) de vacina atenuada de adenovírus humano (HuAd5V) recombinante. Para avaliar a ação de variações significativas da microbiota intestinal e correlacioná-la com a imunogenicidade das vacinas foram traçados dois desenhos experimentais baseados na depleção da microbiota com antibióticos. No primeiro desenho experimental (A), camundongos BALB/c foram tratados com 250 mg de axetilcefuroxima e 25 mg de enramicina diluídos em 250 ml de agua estéril administrado por via oral durante 14 dias. Para o segundo desenho experimental (B) utilizaram-se diferentes combinações de antibióticos não absorvíveis: Gentamicina (G), Metronidazol (M), Neomicina (N) e Vancomicina (V), administrada via oral (1 g/L) durante 14 dias. Durante o tratamento, os animais foram avaliados quanto ao seu desenvolvimento mediante a mensuração do seu peso corporal, e foram também realizadas coletas de fezes para realização de culturas bacterianas e quantificação da microbiota intestinal por PCR quantitativa (qPCR). Os resultados mostraram que o desenho experimental B conseguiu ter uma eficácia maior quanto à depleção da microbiota, apesar de que também foram observadas com ele as maiores taxas de diminuição do peso corporal dos animais. Os grupos de animais tratados com M apresentaram maior redução do peso corporal médio e não tiveram sua microbiota totalmente depletada. Já, uma significativa redução da microbiota foi observada no início do tratamento com NGV ainda sem observar uma redução proporcional do seu peso médio corporal. O resultado mais relevante do nosso trabalho é o que diz a respeito do fato de que a depleção/seleção da microbiota intestinal utilizando NGV e MGV teve impacto significativo na imunogenicidade das vacinas recombinantes adenovirais atenuadas, já que os níveis de anticorpos anti-adenovirais resultantes foram menores, apresentando valores de significância estadística (p) de 0.0154 e 0.0293, respectivamente, em relação ao grupo controle.
; Abstract : Human microbiota is formed by a group of microorganisms that inhabit our body surfaces, such as skin, respiratory or oral mucosa as well as the gastrointestinal (GIT) or genital-urinary (GUT) tracts. Between 18 and 24 months, this microbiota becomes similar to that of an adult human being. One major function of these microorganisms is to stimulate a diversity of immune functions, making our immune system able to perform their homeostasis and defense functions, mainly through the use of a wide arrange of cells and humoral factors that make part of it. Evidences suggest that variations in gut microbiota contents may cause positive or negative alterations in immune responses, thus representing an immune-modulative microenvironment. Disbiosis (lost of equilibrium) may be responsible not only for intestinal tissue damage but also for immune anergy, tolerization or chronic intestinal inflammation, which, if maintained for long periods, may compromise host´s response to antigens, including those that form the vaccines.Our current study had the aim of elucidating the impact that experimental alterations in gut microbiota of mice might have on the immune responses induced in those animals by vaccination. Mice were immunized subcutaneously with 108 pfu/animal (109 pfu/mL) of a human adenovirus type 5 (HuAdV) recombinant attenuated vaccine. To evaluate significant alterations in gut microbial contents and to correlate those with vaccine immunogenicity, two experimental designs were planned, based on different antibiotic usage schedules. In the first experimental design (A), BALB/c mice were treated with 250 mg of axetilcefuroxime and 25 mg of enramicine, diluted in 250 ml of sterile water, administered orally for 14 days. As for the second experimental design (B), different combinations of non-absorbable antibiotics were used: Gentamicin (G), Metronidazole (M), Neomycin (N) and Vancomycin (V), all of them administered orally at 1 g per liter of drinking water for 14 days. During treatment, mouse development was evaluated by measuring body weight, and fecal samples were also collected to perform bacterial cultures and to quantify total gut microbiota by quantitative PCR (qPCR). Results show that experimental design B was more efficient in terms of microbiota depletion; despite the most significant decrease in body weight was also observed in those groups of mice. Mice treated with M displayed a major reduction in body weight and did not have their gut microbiota totally depleted. In contrast, a significant reduction in gut microbiota was observed during the first ten days of antibiotic treatment with NGV, without observing any significant reduction in mean body weight. The most relevant result of our study relates to the fact that depletion/selection of gut microorganisms in animals treated with NGV or MGV had a significant impact in the immunogenicity of our recombinant attenuated viral vaccines, since the levels of anti-adenovirus antibodies detected were significantly lower in those groups of immunized mice when compared to the other groups of mice, with p values of 0.0154 and 0.0293, respectively. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016.

Caracterização molecular da epimedia do HIV-1 em cidades do interior de Santa Catarina e Rio Grande do Sul e filogeografia do subtipo C no Brasil

Thu, 01 Jan 2015 00:00:00 GMT

Caracterização molecular da epimedia do HIV-1 em cidades do interior de Santa Catarina e Rio Grande do Sul e filogeografia do subtipo C no Brasil Gräf, Tiago A epidemia de HIV/aids na região Sul do Brasil é distinta da observada em outras regiões do país. Principalmente nos estados de Santa Catarina (SC) e do Rio Grande do Sul (RS) as taxas de incidência anual de aids e de mortalidade pela doença são bem maiores que a média nacional. Além disso, na mesma região é encontrada grande prevalência de subtipo C enquanto nos outros estados brasileiros há predominância do subtipo B. Uma minuciosa revisão da bibliografia revelou que, apesar de vários estudos já terem descrito a epidemia molecular do subtipo C nas capitais do Sul do Brasil, uma investigação que abrangesse de forma representativa a população dessa região ainda fazia-se necessária. Em vista disso, o trabalho apresentado aqui estudou a epidemia do HIV em 13 municípios do interior dos estados de SC e do RS. Material biológico e dados epidemiológicos de aproximadamente 350 pacientes foram coletados e utilizados para montar um banco de dados com informações moleculares, clínicas e demográficas. Em praticamente todas as cidades amostradas, mas principalmente em SC, o HIV-1 subtipo C mostrou-se como forma predominante. No RS, um número maior de formas recombinantes foi observado com três possíveis novas formas circulantes recombinantes (CRF) identificadas. Análises filodinâmicas revelaram um crescimento mais rápido da epidemia do HIV-1 subtipo C em relação ao subtipo B, sendo esta diferença ainda mais pronunciada em SC, onde também observou-se uma clara segregação dos subtipos virais entre categorias de exposição. Os dados coletados aqui ainda foram utilizados em um estudo filogeográfico para descrever a expansão da epidemia do subtipo C pelo Brasil. Através da análise integrada de dados ecológicos e moleculares foi identificado que a origem dessa epidemia ocorreu em Porto Alegre e a partir desta cidade o subtipo C foi sendo progressivamente introduzido em cidades mais distantes e/ou isoladas. A prevalência de HIV-1 e o número de pessoas infectadas pelo subtipo C foram identificados como preditores da dispersão viral do Sul ao Norte do país. Em conclusão, os resultados apresentados aqui revelam o rápido crescimento que a epidemia do HIV-1 subtipo C teve em SC e RS; discute como a separação em diferentes grupos de exposição pode impactar na velocidade de expansão e também na formação de novas recombinantes; e ainda descreve as rotas de dispersão do subtipo C rumo ao norte do Brasil, alertando para o potencial expansivo dessa epidemia em outras regiões, principalmente no Centro-Oeste.
; Abstract : The HIV/AIDS epidemic in Brazilian Southern region is distinct than that observed in other parts of the country. Mainly in the states of Santa Catarina (SC) and Rio Grande do Sul (RS) the annual aids incidence and mortality rates are far higher than the national average. Furthermore, in the same states HIV-1 epidemic is driven by subtype C, while in other Brazilian regions subtype B is more prevalent. A detailed review of the bibliography revealed that studies describing the molecular epidemiology in south Brazil were mainly performed in the capital cities and that a more comprehensive characterization of the epidemic was necessary. In view of this, the study presented here investigated the HIV epidemic in 13 countryside municipalities form SC and RS states. Blood samples and epidemiological data were collected and assembled in a databank with molecular, clinical and demographic information from around 350 HIV sero-positive individuals. HIV-1 subtype C was observed to be the most prevalent in virtually all sampled locations, with higher frequencies in SC. HIV recombinant forms were observed in higher frequencies in RS, where some possible new CRFs were also identified. Phylodynamic analyses revealed a faster epidemic growth rate for subtype C in comparison with subtype B. This difference was more pronounced in SC where was also observed subtype segregation in categories of exposure. In addition, data collected here was also used in a phylogeographical investigation of the subtype C dispersion throughout Brazil. By using a new approach which integrates ecological and molecular data in the phylogeographical reconstructions, Porto Alegre was found to be the origin of subtype C epidemic and the central hub of dispersion towards north Brazil. HIV prevalence and subtype C population size were identified as predictors of the viral diffusion. In conclusion, the results presented here reveal the fast epidemic growth that subtype C went through in RS and SC; discuss how viral segregation in separated exposure categories can impact in the epidemic growth rates and in the emergence of recombinant forms; and, finally, describe the northward dispersion of subtype C, highlighting the potential to increase in prevalence mainly in Central-West region. Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2015.

Fermentação de maltotriose por leveduras Saccharomyces cerevisiae recombinantes

Thu, 01 Jan 2015 00:00:00 GMT

Fermentação de maltotriose por leveduras Saccharomyces cerevisiae recombinantes Godoy, Victor Ribeiro de Na levedura S. cerevisiae os carboidratos sacarose, maltose e maltotriose são fermentados por vias metabólicas diferentes: a sacarose é hidrolisada pela invertase extracelular (codificada pelos genes SUC), enquanto maltose e maltotriose são ativamente transportadas para dentro da célula e hidrolisadas pelas a-glicosidases presentes no citoplasma (ambas proteínas codificadas pelos genes MAL). Os genes SUC também permitem a síntese de uma forma intracelular da invertase, uma enzima com nenhuma função óbvia em leveduras. No entanto, a sacarose pode também ser metabolizada por células de levedura através dos transportadores e a-glicosidases codificados pelos genes MAL. Nossos resultados mostram que a maltotriose pode ser também eficientemente fermentada pelas células de S. cerevisiae através de seu transporte ativo mediado pela permease AGT1, um transportador MAL necessário para utilização de maltotriose, e sua hidrólise intracelular mediada pela invertase intracelular. A cepa brasileira industrial utilizada na produção de etanol combustível CAT-1 não pode fermentar maltotriose eficientemente devido ao promotor do AGT1 ser defeituoso. Para aumentar a fermentação de maltotriose por esta levedura, colocamos um promotor constitutivo (PGPD) à frente do gene AGT1 presente na cepa CAT-1, gerando a linhagem GMY05. No entanto, esta linhagem não foi capaz de fermentar eficientemente a maltotriose. Por outro lado, quando esta linhagem foi modificada para sobre-expressar a forma intracelular da invertase, por substituição da sequência sinal do gene SUC2 com o promotor constitutivo PADH1, a cepa iSUC2 obtida (GMY08) fermentou maltotriose eficientemente. Utilizando condições em que os genes MAL não são expressos, foi possível mostrar que a forma intracelular da invertase é capaz de hidrolisar a maltotriose (mas não maltose ou p-nitrofenil-a-glicosídico). Assim, os nossos resultados indicam uma sobreposição inesperada no metabolismo de sacarose e maltotriose por células de levedura, indicando que a invertase intracelular pode hidrolisar da maltotriose, e oferece novas abordagens a ser aplicadas para otimizar várias fermentações industriais que utilizam hidrolisados de amido, incluindo a panificação, produção de bebidas destiladas e cerveja, ou inclusive bioetanol.
; Abstract : It is well known that in the yeast S. cerevisiae the sugars sucrose, maltose and maltotriose are metabolized by different pathways: sucrose is hydrolyzed by the extracellular invertase (encoded by SUC genes), while maltose and maltotriose are actively transported into the cell and hydrolyzed by intracellular a-glucosidases (both proteins encoded by MAL genes). Furthermore, the SUC genes also allow the synthesis of an intracellular form of invertase, an enzyme with no obvious function in yeasts. We have already shown that sucrose can be metabolized by yeast cells through MAL-encoded transporters and a glucosidases. Now, our results will show that maltotriose can be efficiently fermented by S. cerevisiae cells through its active transport mediated by the AGT1 permease, a MAL transporter required for maltotriose utilization, and its intracellular hydrolysis mediated by the cytoplasmic invertase. The Brazilian industrial fuel-ethanol strain CAT-1 cannot ferment maltotriose efficiently due to a defective promoter of the AGT1 gene. To increase maltotriose fermentation by this strain, we placed a strong promoter (PGPD) in the AGT1 gene of strain CAT-1, generating strain GMY05. While the AGT1 gene was indeed over-expressed in this strain (measured by real-time PCR), maltotriose was still not fermented efficiently. However, when we over-expressed the intracellular form of invertase, by replacing the signal sequence of the SUC2 gene with the strong PPGK promoter, the resulting iSUC2 strain GMY08 fermented maltotriose efficiently. Using conditions were the MAL-encoded a glucosidases could not be expressed, we showed that the intracellular form of invertase could hydrolyze maltotriose (but not maltose or p-nitrophenyl-a-glucoside). Thus, our results indicate an unexpected overlap in sucrose-maltotriose metabolism by yeast cells, showing that the intracellular invertase allows efficient maltotriose hydrolysis, and offers new approaches that can be applied to optimize several industrial fermentation processes that use starch hydrolysates, including production of bread, distilled beverages and beer, or even bioethanol. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2015.

Caracterização da DICER-LIKE 2 (TrDCL2) de Trypanosoma rangeli

Fri, 01 Jan 2016 00:00:00 GMT

Caracterização da DICER-LIKE 2 (TrDCL2) de Trypanosoma rangeli Yamanaka, Laís Eiko O mecanismo de RNA de interferência (RNAi) é um sistema pós-transcricional de silenciamento gênico com ampla distribuição nos organismos eucariotos. Os pequenos RNA (siRNA e miRNA) são considerados moléculas chaves nesse mecanismo, os quais são gerados pela proteína Dicer. A presença desse sistema parece não seguir um padrão de distribuição filogenético e a sua evolução ainda não foi compreendida. Entre os protozoários, o mecanismo de RNAi está muito bem caracterizado em Trypanosoma brucei, entretanto é ausente em Trypanosoma cruzi e em muitas espécies de Leishmania. O Trypanosoma rangeli não possui vários componentes da maquinaria de RNAi, tornando-a não funcional. Entretanto, o gene que codifica para a Dicer- Like2 (DCL2) foi encontrado completo em seu genoma, enquanto os demais genes codificantes para as outras proteínas da maquinaria estão truncados (pseudogenes). No presente estudo realizamos a caracterização do gene DCL2 de T. rangeli (TrDCL2), o qual apresentou-se como cópia única no genoma do parasito, possuindo uma janela aberta de leitura com 2.667 pb que codifica para uma proteína de 889 aminoácidos (±100 kDa). Foram reveladas diferenças nas sequências aminoacídicas da TrDCL2 entre as cepas KP1(+) e KP1(-) de T. rangeli e devido uma mudança na fase de leitura não é possível identificar os domínios RNAse III nas cepas KP1(-). O gene TrDCL2 é transcrito nas cepas KP1(+), sendo que os níveis de mRNA não apresentam alterações significativas durante o processo de diferenciação celular in vitro do parasito. Visando a avaliação da atividade enzimática e análise da presença e níveis proteicos, realizamos a expressão heteróloga de dois fragmentos e da proteína TrDCL2 inteira. Um dos fragmentos foi utilizado para a produção de um antissoro policlonal anti-TrDCL2. Este antissoro reconheceu uma proteína do tamanho esperado (±100 kDa) nos extratos proteicos totais das formas epimastigotas e tripomastigotas de T. rangeli. Os ensaios de imunofluorescência indireta, utilizando o mesmo antissoro, revelaram uma distribuição difusa da proteína pelo citoplasma de ambas as formas do parasito. A TrDCL2 é expressa em algumas cepas do T. rangeli, entretanto a determinação do seu papel biológico neste parasito ainda permanece a ser elucidada.
; Abstract : The interference RNA mechanism (RNAi) is a system of post-transcriptional gene silencing with wide distribution in the eukaryotes. Small RNA (siRNA e miRNA) are considered key molecules in this mechanism, which are generated by Dicer protein. The presence of this system seems not follow a pattern of phylogenetic distribution and its evolution is still not understood. Between trypanosomatids, the RNAi mechanism is well described in Trypanosoma brucei, but is absent in Trypanosoma cruzi and some Leishmania species. Trypanosoma rangeli does not have many components of RNAi machinery, making it not functional. However, the Dicer-Like2 (DCL2) coding gene was fully encountered in its genome, while the other genes of this machinery are truncated (pseudogenes). In the present study, we have realized the characterization of DLC2 gene of T. rangeli (TrDCL2), which presented a single copy in the parasite genome, having an open reading frame with 2.667 bp that encodes a protein with 889 amino acids (±100 kDa). Differences in aminoacidic sequences were revealed between strains KP1(+) and KP1(-) of T. rangeli and due to a change in the reading phase it was not possible to identify RNAse III domains in the KP1(-) strains. TrDCL2 gene is transcripted in the KP1(+), the mRNA levels do not show significant alterations during the process of cellular differentiation in vitro. Aiming the evaluation of the enzymatic activity and the analysis of the presence of the protein and its levels, we realized the heterologous expression of two fragments and the whole protein TrDCL2. One of the fragments was used to produce a polyclonal antiserum anti-TrDCL2. This antiserum recognized a protein with the expected size (±100 kDa) in the total protein extracts of the epimastigotes and trypomastigotes of T. rangeli. Imunofluorescence assays, using the same antiserum, revealed a diffuse distribution of the protein in the cytoplasm in both forms of the parasite. The TrDCL2 is expressed in some strains of T. rangeli, but the determination of its biological role in this parasite still needs to be elucidated. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2016.