Avaliação da associação células-tronco mesenquimais de placenta humana em biomateriais baseados em celulose bacteriana

Abstract

As células-tronco mesenquimais (CTMs) são amplamente estudadas por apresentarem potencial de auto-renovação e multidiferenciação, além de possibilidade de isolamento a partir de diversos tecidos. A placenta humana representa uma fonte de CTMs abundante, acessível e livre de questionamentos éticos. O comportamento celular está intimamente ligado ao microambiente tridimensional que as cercam no tecido nativo. Em vista disso, biomateriais vêm sendo desenvolvidos na tentativa de mimetizar in vitro esta complexidade tecidual. O hidrogel de celulose bacteriana (HCB), em particular, tem atraído grande interesse devido a sua nanoestrutura, biocompatibilidade e propriedades mecânicas. Por outro lado, a hidroxiapatita (HAp), tem sido usada como um biomaterial promissor para engenharia de tecido ósseo, devido a sua biocompatibilidade e propriedades osteoindutoras. O plasma rico em plaquetas (PRP) mostra-se como uma interessante fonte de fatores de crescimento a ser aplicada com biomateriais. O presente trabalho teve como objetivo principal, avaliar a interação e viabilidade de células-tronco mesenquimais derivadas da placenta humana (CTMPs) em HCB e em um compósito HCB-HAp, bem como analisar a influência do PRP na viabilidade e proliferação das CTMPs. Para isto, isolamos uma população de CTMPs, com morfologia, imunofenótipos e capacidade de diferenciação características de CTMs. Os HCBs foram produzidos por bactérias Gluconacetobacter hansenii cultivadas em um meio de cultivo apropriado e sob circunstâncias estáticas. A interação célula-HCB foi analisada por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia confocal. Os resultados revelaram que as CTMPs apresentam capacidade de aderir ao HCB, porém a interação foi superficial, apresentando pequena capacidade de migração para o interior do biomaterial. Compósitos HCB-HAp foram produzidos através da síntese biomimética de HAp, por imersão dos HCB já sintetizados em soluções de cálcio e fosfato, alternadamente. Foram testados compósitos com cinco concentrações de HAp. A microestrutura e a composição química dos compósitos foram verificadas por MEV e EDS e revelaram o aumento da deposição dos cristais de HAp ao longo dos ciclos. A interação célula-compósito foi verificada por MEV e microscopia confocal, assim como no HCB, a interação foi superficial. O aumento da concentração de HAp nos compósitos prejudicou a adesão e as células tenderam a formar agregados nos compósitos com maior concentração de HAp. Dentre os compósitos, o HCB-HAp1(com apenas um ciclo de deposição de HAp) foi considerado o ideal para estudos futuros. Os efeitos do PRP foram analisados sobre a viabilidade e proliferação celular e demonstrou ter efeito dependente da concentração utilizada, sendo 2% a concentração que mostrou aumento na proliferação celular. Desta forma, concluímos que, para ambos biomateriais, melhorias relacionadas à microestrutura e porosidade devem favorecer migração das CTMPs ao interior do hidrogel e, mediante a estas melhorias, a associação do compósito HCB-HAp1 com CTMPs e PRP, deve formar um sistema de cultivo tridimensional promissor para estudos em engenharia de tecido ósseo.

Mesenchymal stem cells (MSCs) are widely studied due to their self-renewal anddifferentiation potential, in addition to the possibility of isolation from several tissues.The human placenta represents an abundantsource of MSCs, readily accessible and free of ethical questions. The unique cell behavior is closely related to the specialized, three-dimensional microenvironment that immediately surrounds them in native tissue. Inthis way, biomaterials are being developed in an attempt to mimic thiscomplexity in vitro.In particular, bacterial cellulose hydrogel (BCH)has attracted great interest due toits unique nanostructure, biocompatibility and good mechanical properties. On the otherhand, the hydroxyapatite (HAp) has been used as a ubiquitous biomaterial in bone tissue engineering due to its biocompatibility and osteoinductive properties. The platelet rich plasma (PRP) appears as an interesting source of growth factors that may be used together with biomaterials. In this study we evaluated the interaction and viability of human placenta derived mesenchymal stem cells (PMSCs) cultured in BCH and BCH-HAp composite, and analyzed the influence of PRP on the viability and proliferation of PMSCs. We isolate a population of PMSCs with morphology, immunophenotypes and differentiation ability, characteristics of MSCs.The BCHs were producted by Gluconacetobacter hansenii bacteria grown in a suitable culture medium under static conditions. The cell-BCH interaction was analyzed by scanning electron microscopy (SEM) and confocal microscopy. The results revealed that the PMSCs present the ability to adhere to BCH, but the interaction was superficial, presenting low ability to migrate into the biomaterial. BCH-HAp composites were producted by the HAp biomimetic synthesis, by immersing the synthesized BCH in calcium and phosphate solutions. Composites with five concentrations of HAp were tested. The microstructure and chemical composition of the composites were observed by SEM and EDS and revealed increased deposition of HAp crystals along the cycles. The cell-composite interaction was observed by SEM and confocal microscopy and, even as in HCB, the interaction was superficial. The increase of HAp concentration impaired the cell adhesion and the cells tended to form aggregates in the composites with higher HAp concentration. Among the composites, the BCH-HAp1 (with just one HAp deposition cycle) was considered ideal for future studies. The PRP effects were analyzed on cell viability and proliferation and demonstrate to have a concentration-dependent effect. The higher increase in cell proliferation was achieved with 2% PRP. Thus, we conclude that, for both biomaterials improvements related to the microstructure and porosity would be favorable to the PMSCs migration. By these improvements, the association of the composite HCB-HAp1 with CTMPs and PRP must form a promising three-dimensional culture system for studies in bone tissue engineering.