Caracterização fenotípica e molecular da linhagem congênica de ratos SHR.LEW-Anxrr16 como um novo modelo genético para o estudo da ansiedade

Abstract

Um cruzamento entre as linhagens de ratos Lewis (LEW) e Spontaneously Hypertensive Rats (SHR) levou à identificação de um QTL (quantitative trait locus) no cromossomo 4, chamado de Anxrr16, influenciando a locomoção no centro do teste do campo aberto (CA), um índice experimental de ansiedade. Foi observado que, apesar dos animais da linhagem LEW normalmente exibirem um comportamento mais "ansioso" do que os SHR, a presença de alelos da linhagem LEW em Anxrr16 aumentava a locomoção no centro do CA de animais F2, ao contrário do esperado. Uma linhagem congênica (denominada SHR.LEW-Anxrr16, ou SLA16) foi então construída, através de cruzamentos entre as linhagens LEW (doadora) e SHR (receptora), para melhor investigar os efeitos desse locus. Através de testes comportamentais realizados durante a construção desta linhagem (PEREIRA, 2010), o efeito contra-intuitivo desse QTL foi confirmado, entretanto, os dados obtidos não foram conclusivos. O presente estudo teve como objetivos principais o refinamento e a caracterização genotípica e fenotípica da linhagem congênica SLA16, através da genotipagem de três gerações para 20 marcadores moleculares mapeados no cromossomo 4, bem como da avaliação destes animais em testes comportamentais relacionados à emocionalidade. Como uma possível hiperatividade motora foi observada no CA durante o desenvolvimento desta linhagem, e pelo fato da linhagem SHR ser um modelo animal do transtorno do déficit de atenção e hiperatividade (TDAH), a atividade locomotora dos animais congênicos também foi avaliada em ambientes familiares e não-familiares. Além disso, estes animais foram submetidos ao teste da mudança da configuração atencional (MCA) a fim de investigar possíveis efeitos de Anxrr16 sobre a atenção e a flexibilidade comportamental, envolvidos no TDAH. O efeito de Anxrr16 sobre a locomoção no centro do CA foi confirmado. Além disso, esse locus também influenciou medidas de emocionalidade da caixa branca e preta (CBP), do teste triplo (TT) e do labirinto em T elevado (LTE), sempre de maneira contra-intuitiva, de acordo com o estudo que identificou o QTL. Experimentos farmacológicos com uma droga ansiolítica (clordiazepóxido) e uma ansiogênica (pentilenotetrazol), apesar de inconclusivos, sugeriram que o QTL em questão está de fato relacionado à ansiedade. Em relação ao TDAH, diferenças na atividade locomotora foram encontradas, porém, estas desapareceram após um período de habituação, sugerindo que são dependentes do estado emocional do animal e, portanto, não refletem uma hiperatividade espontânea. Efeitos desse locus sobre a atenção e a flexibilidade comportamental não foram detectados, confirmando a ausência de efeito de Anxrr16 sobre fenótipos associados ao TDAH. Com base nestes resultados, conclui-se que o locus Anxrr16, aqui delimitado em uma região do cromossomo 4 de aproximadamente 86 milhões de pares de base, afeta fenótipos associados à ansiedade em ratos, bem como à atividade locomotora em ambientes novos e, portanto, a linhagem congênica SLA16 representa uma importante ferramenta para o melhor entendimento das vias moleculares envolvidas nos comportamentos relacionados à ansiedade.

An intercross between the inbred rat strains Lewis (LEW) and Spontaneously Hypertensive Rats (SHR) led to the identification of a quantitative trait locus (QTL) on chromosome 4, named Anxrr16, influencing locomotion in the central area of the open field (OF) test, an experimental index of anxiety. It was noticed that, even though LEW rats usually display more anxiety-like behaviors than SHR, the presence of LEW alleles on Anxrr16 increased the inner locomotion displayed by F2 animals, contrary to what would be expected. A congenic strain (named SHR.LEW-Anxrr16, or SLA16) was then developed, from a cross between the strains LEW (donor) and SHR (receptor), in order to further investigate the behavioral effects of this locus. Through the behavioral tests performed during the construction of this strain (PEREIRA, 2010), the counterintuitive effect of the Anxrr16 QTL was confirmed, however, the obtained data were not conclusive. The present study's main goals were to refine and characterize genotypically and phenotypically the congenic strain SLA16, by genotyping three generations to 20 molecular markers mapped on chromosome 4, as well as evaluating these animals in emotionality-related behavioral tests. As a possible motor hyperactivity was observed in the OF during the construction of this strain, and for the fact that the strain SHR is an animal model for attention deficit and hyperactivity disorder (ADHD), the locomotor activity of the congenic animals was also evaluated, in familiar and unfamiliar environments. Furthermore, these animals were submitted to the attentional set-shifting (SS) test in order to investigate potential effects of Anxrr16 on attention and behavioral flexibility, traits involved in ADHD. The effect of Anxrr16 over OF inner locomotion was confirmed. Moreover, this locus has also influenced emotionality measures in the light/dark box (LDB), in the triple test (TT) and in the T-maze (TM), in the same counterintuitive manner found in the study that identified Anxrr16 QTL. Pharmacological experiments using an anxiolytic (chlordiazepoxide) and a panicolytic (pentylenetetrazol) drug, although inconclusive, have suggested that this QTL is indeed related to anxiety. Regarding the ADHD phenotypes, differences in locomotor activity were found, however, they have disappeared after a habituation period, suggesting that they depend on the animal's emotional state and, therefore, do not reflect a spontaneous hyperactivity. Effects of this locus over attention or behavioral flexibility were not observed, confirming the absence of Anxrr16 influences on ADHD associated phenotypes. Based on these results, it is concluded that the Anxrr16 locus, herein delimited in a region of chromosome 4 of approximately 86 million base pairs, affects anxiety-related phenoptypes on rats, as well as the locomotor activity in novel places and, for that, the congenic strain SLA16 represents an important tool towards a better understanding of the molecular pathways involved in anxiety-related behaviors.