Aspectos fisiológicos e fitossanitários na micropropagação para a obtenção de alho-semente livre de vírus

Abstract

Com uso intensivo de mão-de-obra, tecnologia e capital, a cultura do alho no Brasil tem viabilizado a pequena e média propriedade nas principais regiões produtoras, sendo portanto, de grande importância sócio-econômica. O alho (Allium sativum L.), por ser propagado vegetativamente, facilita a disseminação de patógenos, como vírus, favorecendo o aparecimento de doenças complexas, pelo acúmulo de diferentes espécies virais numa mesma planta, acarretando diminuição da produtividade e da qualidade do produto. Uma das técnicas mais utilizadas para limpeza clonal de alho é a cultura de meristemas. Apesar de muito utilizada para eliminação de viroses, percebe-se que há uma deficiência nos protocolos atualmente utilizados no que se refere à qualidade da semente produzida. Isto pode estar ligado aos fatores fisiológicos, fitossanitários e, principalmente, à inexistência de estudos para o desenvolvimento de protocolos de limpeza clonal mais eficientes. O presente trabalho teve como objetivos: (i) estudar o padrão de organização morfológica da bulbificação em alho, descrevendo os efeitos dos fatores envolvidos nesse processo; (ii) estudar a morfogênese de plantas de alho in vitro através de avaliações de componentes de meios de cultura e de fatores ambientais que afetam a indução de bulbos; (iii) avaliar as alterações de substâncias endógenas durante o crescimento das plantas e seus efeitos sobre o processo de bulbificação; e (iv) desenvolver um método de crioterapia para remoção do complexo viral do alho a partir do estabelecimento de um protocolo de criopreservação. No Capítulo I, além de um estudo do padrão morfológico da bulbificação, é apresentada uma revisão atualizada dos temas abordados no trabalho com o referencial teórico e as informações disponíveis até o presente. Para o estudo da morfogênese de plantas de alho in vitro foram avaliados os efeitos de tipos e concentrações de reguladores de crescimento e de carboidratos, de períodos de vernalização dos explantes, e os efeitos dos regimes de temperatura e fotoperíodo sobre a diferenciação de gemas de bulbos. As dosagens dos níveis endógenos de Ácido Absíciso e açúcares solúveis totais foram realizadas por testes imunoenzimático-ELISA e pela técnica colorimétrica fenol-sulfúrico, respectivamente. O desenvolvimento do protocolo de criopreservação foi efetuado mediante exposição de ápices caulinares nas soluções de vitrificação PVS2 e PVS3. Posteriormente, a solução com melhor desempenho foi utilizada para crioterapia. A crioterapia foi comparada com os métodos tradicionais de limpeza de vírus em alho. Os resultados aqui apresentados mostram evidências de que plantas de alho cultivadas in vitro também apresentam respostas morfogenéticas para a diferenciação e desenvolvimento de bulbilhos do tipo termo-fotoperiódico dependente. Ficou evidenciado que o tempo de exposiçaõ ao frio reduz a sensibilidade ao fotoperíodo para a indução da bulbificação. Os resultados sugerem a participação do Ácido Abscísico e dos carboidratos solúveis, respectivamente, como agentes inibidores e indutores da bulbificação, em resposta à estímulos climáticos como temperatura e fotoperíodo. Para identificar a real importância desses compostos nesse processo, sugere-se um estudo minucioso da histodiferenciação de bulbos para identificar com maior precisão o momento exato da diferenciação durante a ontogênese das plantas. A solução de vitrificação PVS3 proporcionou a maior taxa de sobrevivência de explantes criopreservados, e foi utilizada no tratamento de crioterapia para erradicação do complexo viral do alho. Entre os diferentes métodos de limpeza de vírus avaliados neste trabalho, a crioterapia de ápices caulinares, associada ou não com a termoterapia, apresentou a maior taxa de eliminação de Onion yellow dwarf virus (OYDV), Garlic common latent virus (GCLV) e, principalmente de Leek yellow stripe virus (LYSV), ausente em 100% das amostras sobreviventes. A imunolocalização de OYDV revelou a presença do vírus em quase todas as partes do ápice caulinar, incluindo a porção distal do domo meristemático e os primórdios foliares. A distribuição dessa espécie de vírus em tecidos de ápices caulinares de alho pode estar associada com o desenvolvimento de plasmodesmos e sua capacidade de dar suporte a sua circulação. Apoiado nessas observações, sugere-se que Onion yellow dwarf virus (OYDV) invade eficientemente as células de ápices caulinares de alho. Os resultados obtidos a partir desse trabalho de tese ampliam a base científica e permitem aprofundar a compreensão dos fatores associados a morfogênese de plantas de alho in vitro. O estabelecimento de um protocolo completo de criopreservação de alho se configura em uma ferramenta para erradicação de viroses em plantas de alho e, sobretudo, para o estabelecimento de um programa de conservação de germoplasma dessa espécie. <br>

Abstract : With the intensive use of labor, technology and capital, the culture of garlic in Brazil has enabled the small and medium property in the main producing regions, thus being of a high socio-economic relevance. Garlic (Allium sativum L.), due to its vegetative propagation, facilitates the spread of pathogens, such as virus, favoring the outbreak of complex diseases, due to the accumulation of different virus species in the same plant. That entails the decrease of productivity and a decrease of the quality of the product. One of the most used techniques for pathogen removal from garlic is the culture of meristems. Even though it is widely used to eliminate viruses, it is easy to perceive that there are deficiencies in the protocols involving the quality of the produced seeds. This may be related to physiological and phytosanitary factors, and also to the lack of studies developing more efficient protocols for pathogen removal. This study has the following objectives: (i) to study the pattern of the morphological organization of garlic bulbing, describing the effects of the factors involved within the process; (ii) to study the morphogenesis of in vitro garlic plants through assessments of the components of the growing medium and the environmental factors that affect bulbing induction; (iii) to assess the changes of endogenous substances during the growth of the plants and their effects on the bulbing process; and (iv) to develop a method of cryotherapy for viral complex removal in garlic, upon the establishment of a protocol for cryopreservation. In chapter I, alongside the study of the morphological pattern of bulbing, it is presented an updated review of the topics tackled within this work, with the theoretical framework and the information available up to the present. For the study of morphogenesis of in vitro garlic plants, it was carried out an assessment of the effects of different types and concentrations of growth regulators and carbohydrates, of the periods of vernalization of plantlets, and the effects of temperature regimes and photoperiods affecting the differentiation of bulb buds. The dosage of the endogenous levels of abscisic acid and total soluble sugars were carried out through immunoenzymatic-ELISA tests and through the colorimetric phenolsulfuric technique, respectively. The development of the protocol for cryopreservation was carried out through the exposure of the shoot tips to the vitrification solutions PVS2 and PVS3. Later, the solution with the best performance was used for cryotherapy. Cryotherapy were compared to the traditional methods for virus removal in garlic. The results reported here evidence that garlic plants grown in vitro also present morphogenetic answers to the differentiation and development of thermo- and photoperiod- dependent bulbils. It also became evident that the time of exposure to cold decreases the sensitivity to the photoperiod for bulbing induction. The results suggest that the abscisic acid and the soluble carbohydrates participate, respectively, as inhibiting agents and bulbing inductors, in response to climatic stimuli such as temperature and photoperiod. To identify the actual relevance of those compounds within this process, it is suggested a thorough study of bulb histodifferentiation in order to identify more precisely the exact moment of differentiation during the ontogeny of the plants. The solution of vitrification PVS3 provided a higher survival rate of cryopreserved plantlets, and it was used in the cryotherapy treatment to eradicate the viral complex from the garlic. Among the different methods for virus removal assessed in this work, the cryotherapy of garlic shoot tips, whether associated with thermotherapy or not, showed a higher frequency in the elimination of the Onion yellow dwarf Virus (OYDV), the Garlic common latent virus (GCLV) and mainly the Leek yellow stripe virus (LYSV), which was absent in 100% of the surviving samples. The immunolocalization of OYDV showed the presence of the virus in almost all parts of the shoot tip, including the distal portion of the meristematic dome and the leaf primordia. The distribution of this species of virus in shoot tip tissues of garlic may be associated with the development of plasmodesms and with its capability to give support to their circulation. Upon these observations, it is suggested that the Onion yellow dwarf virus (OYDV) efficiently invades the cells of the garlic shoot tips. The results achieved by this research project broaden the scientific basis and allow the deepening of the comprehension of the factors associated with the morphogenesis of in vitro garlic plants. The establishment of a complete protocol for the cryopreservation of garlic is a tool for the eradication of viruses in garlic plants and, above all, for the establishment of a program for preserving germplasm of this species.