Análise proteômica de formas tripomastigotas diferenciadas in vitro do Trypanosoma rangeli e caracterização de antígenos diferenciais ao Trypanosoma cruzi

Abstract

A distribuição simpátrica e o compartilhamento de hospedeiros e antígenos entre o Trypanosoma rangeli e o Trypanosoma cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas podem levar a erros nos diagnósticos e inferências epidemiológicas destes parasitos. Neste sentido, apresentamos o primeiro estudo proteômico comparativo em grande escala das proteínas solúveis e de superfície da forma tripomastigota de T. rangeli e de T. cruzi, objetivando a identificação de proteínas com potencial aplicação no diagnóstico diferencial destes parasitos. Neste estudo foram identificadas 137 distintas proteínas solúveis da forma tripomastigota de T. rangeli resolvidas no perfil 2-D por espectrometria de massas (LC-ESI-MS/MS). Destas, 76% localizadas no citosol ou mitocôndrias e 26% envolvidas no metabolismo energético ou na resposta ao estresse. Além disto, através de ensaios de immunoblotting 1-D com estas proteínas solúveis e antissoros de animais experimentalmente infectados com estes parasitos, foi verificado que a reatividade sorológica cruzada existente entre estes dois parasitos não é recíproca, pois o reconhecimento de proteínas da forma tripomastigota de T. rangeli é menos intensa do que o reconhecimento de proteínas da forma tripomastigota de T. cruzi pelos antissoros heterólogos. Também observamos que proteínas das formas tripomastigotas de T. rangeli e de T. cruzi na faixa de 70-80kDa são reconhecidas exclusivamente pelos antissoros homólogos. Nos ensaios de immunoblotting 2-D foi observado um forte reconhecimento de proteínas da forma tripomastigota de T. rangeli pelo antissoro homólogo na faixa entre 60-100kDa. Apesar disto, não foi possível identificar marcadores específicos destes parasitos com estes ensaios. Porém, a análise proteômica comparativa das proteínas de superfície das formas epimastigota e tripomastigota de T. rangeli e de T. cruzi permitiu a identificação de potenciais marcadores específicos de T. rangeli. Esta análise foi realizada utilizando duas abordagens, sem (LC-MS-MS/MS) e com o uso de gel (GeLC-ESI-MS/MS), além de ensaios de immunoblotting 1-D, que revelaram um padrão de reconhecimento das proteínas de superfície distinto para cada espécie. Com isto foi possível identificar 138 proteínas de T. rangeli e 343 proteínas de T. cruzi, das quais 42 e 157 proteínas exclusivamente nas formas tripomastigotas de T. rangeli e de T. cruzi, respectivamente. Em particular, as análises de MS/MS revelaram pelo menos duas proteínas de T. rangeli, GP63-relacionada (~70kDa) e FCaBP (~25kDa), como potenciais alvos para o diagnóstico diferencial com T. cruzi. Desta forma, esta análise proteômica em larga escala das proteínas de superfície de T. rangeli, revelou diferenças e semelhanças entre as proteínas de superfície destes parasitos, além de permitir a identificação de novas proteínas de T. rangeli com potencial aplicação no diagnóstico diferencial com T. cruzi.<br>

Abstract : Sympatric distribution and sharing of hosts and antigens by Trypanosoma rangeli and Trypanosoma cruzi the etiological agent of Chagas' disease, often incur in misdiagnosis and improper epidemiological inferences. In order to identify differential antigens with potential application in serological diagnosis we performed the first high-throughput proteomic analysis of soluble and surface proteins (SP) of T. rangeli and T. cruzi trypomastigotes. In this work, 137 non-redundant T. rangeli trypomastigote soluble proteins resolved in 2-D profile were identified by mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). Within these 137 non-redundant proteins, 76% are cytosolic or mitochondrial and 26% are involved in energy metabolism or response to stress. Furthermore, 1-D immunoblotting assays with soluble proteins and antisera from animals experimentally infected showed a less intense recognition of T. rangeli trypomastigotes soluble proteins than T. cruzi trypomastigotes proteins by heterologous antisera indicating that serological cross-reactivity between these parasites is not reciprocal. In addition, T. rangeli and T. cruzi trypomastigotes soluble proteins between ~70-80 kDa were exclusively recognized by homologous antisera suggesting specie-specific antigens among the trypomastigote proteins. We also observed a strong recognition of T. rangeli trypomastigotes proteins by homologous antiserum between ~60- 100kDa in 2-D immunoblotting tests. Unfortunately, we were not able to identify specific markers of these parasites through these trials. On the other hand, the comparative proteomic analysis of T. rangeli and T. cruzi epimastigote and trypomastigote SP pointed out potential T. rangeli specific-markers, using gel-free (LC-ESI-MS/MS) and gel-based (GeLC-ESI-MS/MS) proteomic approaches. Besides, immunoblotting revealed distinct recognition profiles of SP for each species. A total of 138 T. rangeli proteins and 343 T. cruzi proteins were identified, of which, 42 and 157 proteins were exclusively identified in T. rangeli or T. cruzi trypomastigotes, respectively. MS/MS analysis of T. rangeli exclusive bands revealed two unique proteins, GP63-related (~70kDa) and flagellar calcium-binding protein (FCaBP) (~25kDa), as potential markers. This highly sensitive proteomic assessment of surface proteins characterized the T. rangeli surfaceome, revealing several differences and similarities between these two parasites and new T. rangeli-specific proteins with promising use in differential diagnosis from T. cruzi.