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Abstract:
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Cedrela fissilis Vellozo (Meliaceae) é uma espécie nativa da Floresta Atlântica, que produz madeira de grande valor econômico. Os objetivos deste trabalho foram estudar o crescimento de calos em diferentes condições de cultivo, realizar análises preliminares do teor de óleos essenciais e dos constituintes voláteis produzidos pelos mesmos e desenvolver estudos sobre a criopreservação de sementes e conservação in vitro de propágulos vegetativos. Em todos os experimentos foram utilizados segmentos nodais cotiledonares, exceto para testar o efeito de diferentes tipos de explantes, em que segmentos apicais e foliares também foram utilizados. O meio de cultura Murashige & Skoog foi utilizado em todos os experimentos, suplementado com 2,5 M de 6-benzilaminopurina (BAP) e 5 M de ácido a-naftalenoacético (ANA), 0,2% de Phytagel e com 58,4 mM de sacarose, exceto nos casos em que outras fontes de carbono foram testadas ou em que foram testadas diferentes concentrações de sacarose na ausência ou na presença de glutamina ou em que diferentes concentrações de BAP e ANA foram utilizadas separadamente ou em combinação. As culturas foram mantidas em sala de crescimento com temperatura controlada de 25 2ºC, sob fotoperíodo de 16 horas (exceto as submetidas ao escuro), provido por lâmpadas fluorescentes Philips TDL (22.3 µmol.m-².s-¹) e foram avaliadas, após quatro e oito semanas, dependendo do experimento, através da determinação da massa fresca, massa seca e do teor de água. Os óleos essenciais foram extraídos por hidrodestilação de calos crescidos na luz em 2,5 M de BAP e 5 M de ANA . A extração dos constituintes voláteis foi realizada pelo método líquido-sólido e análise através de cromatografia gasosa. As sementes criopreservadas foram descongeladas em temperatura ambiente ou a 45 C, em banho-maria, por três minutos. Os segmentos nodais foliares foram armazenados, por seis semanas em meio de cultura Murashige & Skoog, com metade da concentração salina, desprovido de sacarose, a 25 C e a 5 C e após o período de armazenamento transferidos para o meio de cultura Murashige & Skoog, suplementado com 2,5 M de BAP e 5 M de ANA. Nenhuma diferença foi detectada entre os valores de massa fresca dos calos iniciados a partir de segmentos nodais cotiledonares e apicais e os maiores valores foram obtidos com 2,5 M de BAP e 5 M de ANA. Não foram detectadas diferenças entre os maiores valores em massa seca de calos iniciados a partir de segmentos nodais cotiledonares e foliares, obtidos com oito semanas de cultivo. Os calos iniciados a partir de segmentos nodais cotiledonares cresceram em todas as combinações de ANA e BAP testadas. Os maiores valores de massa seca foram obtidos em 2,5 M de ANA com 2,5 M de BAP, 5 M de ANA e 2,5 M ou 5 M de BAP. A maior massa seca dos calos ocorreu após oito semanas de cultivo em sacarose, sendo os valores observados para glicose e frutose semelhantes. Os maiores valores de massa seca dos calos foram obtidos com 58,4 mM ou 116,8 mM de sacarose e com 87,6 mM de sacarose e 2,73 mM de glutamina. Os calos apresentaram maior massa seca na luz, com oito semanas de cultivo e maior teor de água no escuro. Calos produzidos a partir de plântulas de diferentes idades não diferiram em massa seca, apenas no teor de água, que foi maior para os calos obtidos de explantes de plântulas com cinco semanas de idade. O rendimento de óleos essenciais extraídos por hidrodestilação, produzidos pelos calos foi de 1,17 % da massa seca. O linalol foi o composto majoritário produzido por calos crescidos na luz ou no escuro. Sete compostos voláteis foram identificados em calos crescidos no escuro e doze foram identificados em calos crescidos na luz. O germacreno apareceu em maior proporção nos calos crescidos na luz. A massa seca dos calos produzidos a partir de segmentos nodais foliares armazenados por seis semanas a 5 C foi maior do que a massa seca dos calos produzidos pelos segmentos apicais, não havendo diferença entre as massas secas quando ambos os explantes foram armazenados a 25 C. As sementes toleraram a criopreservação por quinze meses e o descongelamento lento. O estabelecimento de diferentes condições de cultivo de calos, a detecção de compostos de interesse nos mesmos e o estabelecimento de métodos que permitem a criopreservação, por longos períodos de tempo, e a conservação in vitro, por curtos períodos de tempo, de propágulos vegetativos indicam o potencial da aplicação de abordagens biotecnológicas para a produção de metabólitos secundários e conservação de germoplasma desta espécie. Cedrela fissilis Vellozo (Meliaceae) is a native species of the Atlantic Forest, important for timber production. The aim of this work is to study callus growth in different culture conditions, to carry out preliminary analysis on the content of essential oils and its volatile components and to develop studies on seed cryopreservation and in vitro conservation of vegetative propagules. Cotyledonary nodal segments were used in all experiments, except when different type of explants were used. The Murashige & Skoog medium supplemented with 2,5 M 6-benzilaminopurine (BAP) and 5 M a-naphtaleneacetic acid (ANA), 0,2% Phytagel and 58,4 mM sucrose was used in all experiments, except when different carbon sources, different sucrose concentration, in the absence or presence of glutamine or different concentration of BAP and ANA, isolated or combined, were tested. The cultures were maintained under 25 2ºC, 16 hours photoperiod (except those kept in the dark), provided by fluorescent Philips TDL (22.3 µmol.m-².s-¹) tubes and were assessed after either four or eight weeks, depending on the experiment, for fresh mass, dry mass and water content. The essential oils were extracted by hydrodistillation from callus grown under light in 2,5 M BAP and 5 M ANA. The extraction of volatile components was carried out through the liquid-solid method and the analysis by gas chromatography. Seeds cryopreserved in liquid nitrogen and thawed either at room temperature or at 45 C, in a water bath, for three minutes. Leaf nodal segments and apical shoot segments were stored at either 25 C or 5 C, for six weeks in half strength Murashige & Skoog medium, deprived of sucrose, and transferred, after storage, to the Murashige & Skoog medium supplemented with 2,5 M BAP and 5 M ANA. No differences were detected in the fresh mass of calluses initiated either from cotyledonary nodal segments or apical segments and the highest values were obtained in the culture medium with 2,5 M BAP and 5 M ANA. No differences were detected in the highest dry mass values of calluses initiated from either cotyledonary nodal segments or leaf nodal segments, after eight weeks of culture. Growth of calluses initiated from cotyledonary nodal segments was achieved in all combination of ANA and BAP tested. Superior values of dry mass were obtained in 2,5 M ANA with 2,5 M BAP, 5 M ANA and 2,5 M or 5 M BAP. The highest callus dry mass occurred after eight weeks of culture in sucrose, and similar values were obtained for glucose and fructose. Superior values of callus dry mass were obtained on either 58,4 mM or 116,8 mM sucrose and on 87,6 mM sucrose and 2,73 mM glutamine. Calluses showed higher dry mass in the light, when cultivated for eight weeks. Calluses produced from seedlings with different age did not differ in dry mass, only the water content was higher in callus obtained from explants of five week-old seedlings. The content of essential oils produced by the callus was 1,17 % of the dry mass. Linalool was the major compound produced by callus grown either under light or in the dark. Seven volatile compounds were identified in callus grown in the dark and twelve were identified in callus grown in the light. Germacrene appeared in higher proportion in the callus grown in the light. The dry mass of calluses produced from leaf nodal segments stored for six weeks at 5 C was higher than the dry mass of calluses produced from the apical segments, and no difference in the dry mass was detected when both explants were stored at 25 C. Seeds tolerated cryopreservation for fifteen months and the slow thawing. The establishment of different callus culture condition, the detection of important compounds produced by the callus and the establishment of methods which allow long term seed cryopreservation, and short term in vitro conservation of vegetative propagules indicate the potential of application of biotechnological approaches for the production of secondary metabolites and germplasm conservation of this species. |
