Obtenção de um biocatalisador da protease TEV para a remoção de caudas de histidinas de proteínas recombinantes

Abstract

O uso de caudas de afinidade tem facilitado a purificação de proteínas recombinantes para aplicações bioquímicas, terapêuticas e estudos estruturais. A cauda mais comum é a cauda contendo seis-histidinas (His-tag) porque permite a purificação das proteínas recombinantes por cromatografia de afinidade. Em alguns casos, as caudas de tamanhos maiores podem aumentar a solubilidade da proteína de interesse. Em outros, a presença da cauda pode alterar a conformação estrutural da proteína, a atividade, interações proteína-proteína e a formação de cristais com um bom padrão de difração, necessário para elucidar a estrutura tridimensional. Todos esses efeitos negativos reforçam a importância de realizar uma caracterização funcional das proteínas expressas com caudas e que a clivagem das mesmas é de grande utilidade antes de realizar estudos funcionais e estruturais. A protease TEV é uma das mais utilizadas para clivar a cauda de proteínas recombinantes porque ela reconhece uma seqüência de aminoácidos muito específica (EXXYXQ*S/G) (onde X pode ser qualquer resíduo) e é ativa a baixas temperaturas e na presença de inibidores de protease adicionados durante o processo de purificação. A protease TEV é disponível comercialmente na forma solúvel, porém é muito cara. Quando a TEV é utilizada na forma solúvel, ela deve ser separada da proteína de interesse. Esta separação é normalmente realizada por uma etapa de cromatografia de exclusão molecular, que permite a separação da cauda, da proteína clivada e não clivada. Nos casos em que a proteína de interesse possua uma massa molecular semelhante a protease TEV, são necessárias etapas adicionais de purificação diferentes da gel filtração. Quando um grande número de proteínas é estudada, como nos projetos de genômica estrutural para a cristalização de proteínas, a produção da TEV deve ser contínua nos laboratórios, aumentando o custo do processo de purificação. Neste trabalho, a protease TEV foi produzida e imobilizada em diferentes suportes visando obter um biocatalisador ativo, estável e que possa ser reutilizado em vários processos de clivagem de caudas de histidina de proteínas recombinantes. Para isso, foram utilizadas três estratégias: a primeira pela imobilização no suporte glutaraldeído-agarose (G-agarose) que permite a ligação da TEV pelos grupos e-amino das lisinas. A segunda pela imobilização em tiolsulfinato-agarose (TSI-agarose) pela união da proteína pelos grupos tiol das cisteínas e a última pela imobilização pelos grupos tiol e por outros nucleófilos da superfíce da TEV. O rendimento da purificação das proteínas a partir de 1 litro de cultivo foi de 20 mg para a TEV e 5 mg para o substrato da TEV. A protease TEV imobilizada em TSI-agarose clivou 100% do substrato em 24 h a temperatura ambiente e a imobilizada em G-agarose clivou 50% do substrato nas mesmas condições. A TEV imobilizada em TSI-agarose foi mais estável que a enzima solúvel durante um período de armazenamento de 16 dias a 4°C e pode ser reutilizada em pelo menos cinco ciclos de clivagem.