Avaliação do potencial de diferenciação das células da crista neural truncal de aves cultivadas sobre Matrigel

Abstract

A Crista Neural (CN) constitui uma população de células que emergem a partir das pregas dorsais do neuroepitélio durante a neurulação. Estas células migram ao longo de todo o eixo antero-posterior embrionário dos vertebrados até encontrarem seus locais definidos onde irão diferenciar em diversos derivados neurais e mesenquimais. As células da CN cefálica (CNC) e da CN Truncal (CNT) podem dar origem a neurônios e células gliais do sistema nervoso periférico, melanócitos e células endócrinas. Diferentemente do que ocorre com a CNC, a CNT possui uma limitada capacidade de originar elementos mesenquimais in vivo. Entretanto, sob determinadas condições in vitro, a CNT pode originar fenótipos mesenquimais. Até o momento, a maior parte dos estudos com a CNT foram realizados sobre substratos bidimensionais (2D), geralmente revestidos moléculas isoladas da matriz extracelular (colágeno, laminina, fibronectina) ou sobre monocamadas de fibroblastos embrionários (3T3). Atualmente, sabe-se que este tipo de ambiente não reflete a complexa fisiologia dos tecidos in vivo. No presente estudo nós realizamos cultivos de células isoladas da CNT sobre um extrato solúvel da membrana basal, comumente denominado de Matrigel. Elaboramos uma metodologia que permitiu criar dois microambientes dentro do mesmo poço de cultivo: um ambiente bidimensional (2D) e um ambiente tridimensional (3D). Verificamos que o Matrigel permite a diferenciação dos principais fenótipos da CNT (neurais: células gliais, células musculares lisas, neurônios, melanócitos e mesenquimais: condrócitos). Embora tenham sido observadas algumas variações na obtenção dos fenótipos descritos conforme o lote de Matrigel utilizado, o uso de uma mistura destes lotes permitiu normalizar a frequência de poços de cultivo contendo cada tipo celular. Além disso, 70% dos poços de cultivo apresentavam nódulos de cartilagem, os quais frequentemente se encontravam na região 3D. Interessantemente, esta frequência de condrócitos detectada utilizando um microambiente 3D de Matrigel, resultou ser muito maior quando comparado a trabalhos anteriores realizados sobre ambientes 2D convencionais. Estes dados sugerem que o Matrigel pode ser um ótimo substrato para estudar a diferenciação e multipotencialidade das células da CN.

Abstract : The Neural Crest (NC) is a cell population that detach from dorsal neural folds during neurulation. These cells migrate along the entire vertebrate embryonic axis until they find their final destination and differentiate into both neural and mesenchymal phenotypes. Cephalic NC (CNC) and Trunk NC cells (TNCCs) give rise to neurons and glia from the peripheral nervous system, melanocytes and endocrine cells. Differently from CNC, TNC have a limited capacity to give rise to mesenchymal derivatives in vivo. Nevertheless, under special culture conditions, TNC can give rise to mesenchymal phenotypes. Until now, most of studies of TNC were conducted on 2D substrates, usually covered with extracellular matrix molecules (e.g. collagen, laminin, fibronectin) or under fibroblast feeder-layers (3T3). Nowadays, it is worth knowing that this kind of environment does not mimic the complex tissue physiology in vivo. In the present study, we conducted cell cultures isolated from TNC on a soluble extract of basal membrane, commonly named Matrigel. We performed a new methodology that permitted to create two microenvironments in the same culture well: a two-dimensional (2D) and a three-dimensional (3D) environment. We observed that Matrigel permits the differentiation of the main TNC phenotypes (glial cells, melanocytes, smooth muscle cells, neurons and chondrocytes). Even though we observed some described variations on the phenotypes obtained according to the Matrigel lot used, the use of a mixture of lots allowed normalizing the frequency of culture wells containing each cell type. Moreover, 70% of culture wells contained cartilage nodules, which were frequently on the 3D zone. Interestingly, this frequency of chondrocytes detected using a 3D microenvironment of Matrigel resulted even higher than previous reports performed on traditional 2D cultures. Together, this data suggest that Matrigel could be an excellent substrate to study NC differentiation and multipotenciality.