Comparação entre a absorção de vicilinas de sementes suscetíveis e resistentes do feijão-de-corda, vigna unguiculata pelo epitélio intestinal de larvas do caruncho callosobruchus maculatus e o processamento de vicilinas no corpo gorduroso após absorção

Abstract

Os animais pertencentes à subfamília Bruchinae são os principais predadores das sementes de leguminosas, destacando-se pela restrição na dieta alimentar ocorrendo especificidade ao nível de gênero ou família. O caruncho do feijão-de-corda (Callosobruchus maculatus) é o maior predador de sementes de Vigna unguiculata (feijão-de-corda) tanto no campo quanto de grãos armazenados. O feijão-de-corda apresenta em sua composição uma família de proteínas multifuncionais chamadas de vicilinas (globulina 7S), possuindo uma massa molecular de aproximadamente 190 kDa. Vicilinas variantes expressas em sementes de V. unguiculata vem sendo associadas diretamente aos efeitos tóxicos causados nas larvas dos bruchideos. Aqui relata-se o valor adaptativo envolvido na absorção das vicilinas e o mecanismo da resistência associado ao C. maculatus. O genótipo (IT81D-1053) de V. unguiculata mostrou-se resistente ao bruchideo (C. maculatus), não havendo emergência de adultos no período de 90 dias, enquanto sementes suscetíveis (fradinho) apresentaram emergência média de 36,42±0,59 dias. O destino das vicilinas foi acompanhado por microscopia de fluorescência, através de cortes por congelamento (criostato), ao alimentaram-se as larvas do bruchideo com vicilina suscetível/FITC, vicilina variante/FITC e com faseolina/FITC (Phaseolus vulgaris) notando-se diferença no processo absortivo entre as dietas testadas. O epitélio intestinal das larvas alimentadas com vicilina variante/FITC e faseolina/FITC apresentou por fluorescência maior quantidade de vicilina. Por microscopia eletrônica foi possível verificar a presença da proteína suscetível (fradinho) no interior das células do epitélio intestinal das larvas de C. maculatus. Evidenciando que as vicilinas se ligam aos receptores na membrana das microvilosidades e posteriormente, são absorvidas em forma de vesículas no interior das células epiteliais do intestino médio das larvas, sendo possivelmente, mediado por processo de endocitose. As moléculas de vicilinas nas vesículas formadas no epitélio intestinal são encaminhadas ao corpo gorduroso das larvas, onde foram isoladas por ultracentrifugação em gradiente descontínuo de sacarose. Essas foram caracterizadas parcialmente com a utilização do substrato vicilina 0,1% (m/m) juntamente com os inibidores EDTA (ácido etileno diamino tetra acético), pepstatina A, PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonil) e E-64 (trans-epoxisuccinil 4-guanidino butano), onde a Pespatina A e PMSF inibiram o processamento da vicilina, sugerindo há uma combinação de enzimas, possivelmente proteinases serínicas e aspárticas, atuando na hidrólise da vicilina, porém não foi possível identificar qual classe mecanística é responsável pelo início do processo <br>

Abstract: The animals of the Bruchinae subfamily are the main predators of legume seeds, which are distinguished by the food diet restriction, occurring specificity on genus or family level. The cowpea beetle (Callosobruchus maculatus) is the main predator of the Vigna unguiculata seeds (cowpea) in the field and stored grains. These beans present in their composition a family of multifunctional proteins called vicilins (7S globulin), with around 190 kDa as molecular weight. Variant vicilins expressed in the seeds of V. unguiculata have been directly associated to the toxic effects caused in bruchid larvae. Here we report the adaptive value involved in the uptake of vicilin and resistance mechanisms associated with C. maculatus. The genotype (IT81D-1053) of V. unguiculata was resistant to bruchid (C. maculatus) without adult emergence in a period of 90 days, while susceptible seeds (fradinho) presented emergency of 36.42 ± 0.59 days on average. The fate of vicilin was followed by fluorescence microscopy, cutting the gel (cryostate), where bruchid the larvae are fed with vicilin susceptible/FITC, vicilin variant/FITC and phaseolin/FITC (from Phaseolus vulgaris) noticing the difference in the absorptive process. The intestinal epithelium of larvae fed on vicilin variant / FITC and phaseolin / FITC fluorescence showed a greater amount of vicilin. By using electron microscopy, it was possible to verify the presence of the susceptible vicilin (fradinho) in the cells of the intestinal epithelium of larval C. maculatus. Vicilins seem to bind to receptors in the membrane of the microvilli and subsequently are absorbed in the form of vesicles inside the cells of the epithelium of the gut of the larvae, and optionally mediated endocytosis. The vicilin molecules present in the vesicles formed in the intestinal epithelium are transferred to the fat body larvae, where they could be isolated by discontinuous sucrose gradient after ultracentrifugation. They were partially characterized using 0.1% (w / w) vicilin as the substrate in the presence or not of following inhibitors EDTA (ethylene diamine tetra acetic acid), pepstatin A, PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride) and E-64 (trans epoxisuccinil -4 guanidino-butane), wherein pepstatin A and PMSF inhibited the processing of vicilin, suggesting that it is a combination of enzymes, perhaps aspartic and serine proteinases, acting on the hydrolysis of vicilin. However, it was not possible to identify the mechanistic class which is responsible for initiating the process.