Diferenciação in vivo de células-tronco mesenquimais de placenta humana em fenótipo neural e seu potencial terapêutico para o tratamento de acidente vascular cerebral

Abstract

As células-tronco (CTs) são células indiferenciadas com habilidade de se autorrenovar, e que em condições apropriadas podem gerar diversos tipos celulares maduros. As células da placenta possuem características morfológicas, imunofenotípicas e funcionais, similares as células tronco mesenquimais (CTMs) da medula óssea (MO), porém é improvável que estas células possuam o mesmo potencial de diferenciação e proliferação de CTs embrionárias. Estas células são ainda de origem fetal e podem ser superiores a CTs somáticas em muitos aspectos. Juntamente com o seu fácil acesso, ausência de problemas éticos e abundância celular, as CTMs da placenta podem ser uma alternativa atrativa de progenitores de CTs para pesquisa básica e aplicações clínicas. O Acidente Vascular Cerebral (AVC) é uma das principais causas de morte e incapacitação no Brasil, trazendo altos custos para o Sistema Único de Saúde (SUS), sendo então de grande importância estudos que permitam melhorar este quadro. Também é importante o estudo do microambiente, pois este e as CTs regulam-se de forma dinâmica e também, torna-se relevante o estudo de fatores de crescimento que podem estar envolvidos na diferenciação das CTMs onde são escassos os estudos. Nesta tese investigamos o potencial de diferenciação das CTMs de placenta humana, in vitro e in vivo, utilizando modelo de co-cultura e AVC respectivamente. Para alcançarmos nossos objetivos, foram realizadas culturas de CTMs de placenta humana, bem como cultura mistas de cerebelo e córtex de ratos neonatos. Foram realizados experimentos de co-cultura para verificação da importância do microambiente neural na diferenciação de CTMs, bem como injeção de CTMs em animais que sofreram lesão causada pelo AVC para possível regeneração da área lesionada. Também investigamos os fatores de crescimento expressos pelas culturas mistas que poderiam estar envolvidos no processo de diferenciação de CTMs para fenótipo neural. As análises dos experimentos se deram por RT-PCR e imunofluorescência, utilizando marcadores de células precursoras neurais, células gliais e neurônios. Nossos resultados demonstram que as CTMs quando em microambiente favorável, têm a potencialidade para diferenciar-se em fenótipos neurais, estes resultados são vistos quando as CTMs são co-cultivadas com culturas mistas de cerebelo e córtex de ratos neonatos, bem como quando injetadas no encéfalo de animais lesionados experimentalmente por AVC, demonstrando a potencialidade das CTMs da placenta humana na diferenciação neural. Além de apresentarem expressão gênica, estas células possuem a expressão protéica de Nestina, GFAP e B-Tubulina III e também as alterações morfológicas necessárias na diferenciação. Sugerimos a participação na diferenciação o fator de crescimento EGF e transcrição FOXD3 que deixam de ser expressos em culturas mistas de córtex após o co-cultivo com CTMs. Este trabalho demonstrou que CTMs de placenta humana possuem interação com o microambiente indutivo, podendo apresentar morfologia neural; e quando enxertadas em animais que sofreram lesão isquêmica, podem migrar para o local da lesão e diferenciar em células neurais in situ, podendo assim ter utilização terapêutica na medicina regenerativa. <br>

Abstract : Stem cells (SCs) are undifferentiated cells with the ability to self-renew and under appropriate conditions may generate various differentiated cell types. Placental cells have morphological, functional and immunophenotypic similar to mesenchymal stem cells (MSCs) from bone marrow (BM), but it is unlikely that these cells have the same potential for differentiation and proliferation of embryonic SCs. These cells are also of fetal origin and may be superior to somatic SCs in many ways. Along with its easy access, lack of ethical problems and cell abundance, MSCs from the placenta can be an attractive alternative for parents of SCs for basic research and clinical applications. The Cerebral Vascular Accident (CVA) is a major cause of death and disability in Brazil, bringing high costs to the National Health System (SUS), which is of great importance studies to improve this situation. Also important is the study of microenvironment, as this and SCs are regulated dynamically and also becomes relevant to the study of growth factors that may be involved in the differentiation of MSCs where there are few studies. We investigated the differentiation of human placenta MSCs in vitro and in vivo using co-culture model and experimental stroke in mice respectively. We performed cultures of MSCs from human placenta and carried out co-cultures on rat cerebellum or cortex cells from newborn rats. In co-culture assays the importance of the microenvironment was checked as an inducer for neural differentiation of MSCs. Alternatively the graft of MSCs in mice with moderate brain injury in experimental stroke to test for possible regeneration of damaged area. We also investigated growth factors expressed by mixed cultures that could be involved in the differentiation of MSCs to neural phenotype. We analyzed the expression or neural markers in MSCs by RT-PCR and immunohistochemistry. Our results demonstrated that MSCs in contact to brain microenvironment have the potential to differentiate to neural phenotypes. MSCs expressed nestin, GFAP and Tubulin III-B. These results were observed when MSCs were co-cultured with mixed cultures of cerebellum and cortex from newborn rats or when they were injected into the brain of animals injured by experimental stroke. This seemed to be under control of EGF and the transcription factor FoxD3 that failed to be expressed in mixed cultures of cortex after co-culture with MSCs. This work demonstrated that MSCs from human placenta have inductive interaction with the microenvironment may present neural morphology, and when grafted into animals undergoing ischemic injury, can migrate to the site of injury and differentiate into neural cells in situ and may thereby have therapeutic use in regenerative medicine.