Influência de células tronco mesenquimais de placenta humana sobre a biologia de neurônios e astrócitos de camundongos

Abstract

O Acidente Vascular Cerebral (AVC) isquêmico é uma das doenças que mais levam a óbito no mundo, sendo uma das doenças neurológicas que podem levar a um permanente dano neuronal. O único tratamento aprovado para o AVC agudo é a terapia trombolítica intravenosa, realizada através do ativador de plasminogênio tecidual recombinante (rtPA), que deve ser administrado ao paciente em no máximo quatro horas e meia após a lesão, restringindo o tratamento a poucos pacientes. Portanto, é necessário um novo tratamento, como a terapia com células tronco (CT). Uma fonte de CT promissora é a placenta humana, cujas CT mesenquimais tem reconhecida ação imunossupressora e capacidade de diferenciação para fenótipos neurais. No entanto, antes de partir para uma terapia celular, é necessário conhecer os mecanismos pelos quais as CT irão atuar, como secreção de fatores e influência das mesmas sobre a biologia de astrócitos e neurônios de camundongos, que foi o objetivo de nosso trabalho. Para isso, foram realizados experimentos de co-cultura e a utilização de meio condicionado (MC) de células tronco mesenquimais de placenta humana (CTMPHs) derivadas do córion. O MC das CTMPHs foi utilizado em diferentes concentrações (10%, 25%, 50% e 75%) sobre culturas de astrócitos e culturas de astrócitos e neurônios de camundongos neonatos, e a co-cultura foi realizada com CTMPHs sobre culturas de astrócitos e culturas de neurônio, também de camundongos neonatos. Após, as células foram fixadas e imunocitoquímicas para GFAP e ?-tubulina III foram efetuadas. As células foram contadas e analisadas estatisticamente através do teste ANOVA de 1 via e o pós-teste de Newman - Keuls. Também realizamos marcação para Sytox, afim de verificar a mortalidade celular, em todos os experimentos, e em um grupo de culturas de astrócitos que receberam MC de CTMPHs realizamos o ensaio de MTT para analisar a viabilidade celular. Pudemos concluir que o MC das CTMPHs e a co-cultura com as mesmas não é citotóxico para astrócitos e neurônios, pois não obtivemos marcações positivas com Sytox, assim como no ensaio com MTT, em astrócitos que receberam diferentes concentrações de MC, não houve diferença estatística entre os grupos tratados em comparação aos controles. O MC em baixas concentrações (10% e 25%) não mostrou diferenças em relação ao grupo controle, quando analisou-se a quantidade de células GFAP e ?-tubulina III positivas. Já em altas concentrações (50% e 75%), o MC diminuiu a proliferação dos astrócitos (células GFAP positivas) e aumentou a neuronal (células ?-tubulina III positivas). Em relação a co-cultura, o resultado foi o mesmo. Também notamos a presença de neurônios bipolares, maior no grupo que recebeu 75% de MC, e um aumento nos prolongamentos neuronais nos tratados com 50% e 75% de MC e na co-cultura. Juntos, estes resultados nos permitem concluir que as CTMPHs são uma alternativa eficaz para terapias celulares para o AVC ou outras doenças cerebrais.<br>

Abstract : The ischemic stroke is one of the most important disease that lead to death in the world, and one of neurological diseases that can lead to permanent neuronal damage. The only approved treatment for acute stroke is the intravenous thrombolytic therapy, performed using recombinant tissue plasminogen activator (rtPA), that must be administered to the patient within four hours and a half after the injury, restricting the treatment to a few patients. Therefore, a new treatment is required, like stem cell (SC) therapy. A SC promising source is human placenta, whose mesenchymal SC has recognized immunosuppressive action and capacity for differentiation to neural phenotypes. However, before going for a cell therapy, it is necessary to know the mechanisms by which SC will act, as secretion of factors and their influence on the biology of neurons and astrocytes of mice, which was the goal of our work. For this, experiments were carried out using co-culture and conditioned medium (CM) from mesenchymal stem cells from human placenta (MSCHP) derived from the chorion. The CM of MSCHP was used at different concentrations (10%, 25%, 50% and 75%) in astrocyte cultures and cultures of neurons and astrocytes from neonatal mice, and co-culture was performed with MSCHP on astrocyte cultures and cultures of neurons, also of newborn mice. Following, the cells were fixed and a immunocytochemistry for GFAP and ?-tubulina III were performed. Cells were counted and analyzed statistically by 1-way ANOVA test and post-test Newman - Keuls. We also perform marking to Sytox in order to check the cell mortality, in all experiments, and a group of astrocyte cultures that received CM from MSCHPs performed the MTT assay to analyze cell viability. We concluded that the CM of MSCHP and co-culture with them is not citotoxic to neurons and astrocytes, as we have not had positive reactions with Sytox, as well as the MTT assay in astrocytes that received different concentrations of CM, there was no statistical difference between the treated groups compared to controls. The CM at low concentrations (10% and 25%) showed no differences compared to control group, when we analyzed the number of GFAP and ?-tubulina III positive cells. Already at high concentrations (50% and 75%), CM decreased proliferation of astrocytes (GFAP positive cells) and increased neuronal cells (?-tubulina III positive cells). Regarding co-culture, the result was the same. We also noted the presence of bipolar neurons, increased in the group receiving CM 75%, and an increase in neuronal extensions treatedwith 50% and 75% CM and co-culture. Together, these results allow us to conclude that the MSCHP are an effective alternative to cellular therapies for stroke and other brain diseases.