Cárie severa na infância: avaliação da estrutura de comunidades bacterianas e perfil de sensibilidade a antimicrobianos

Abstract

O objetivo desta pesquisa foi avaliar a estrutura da comunidade bacteriana do biofilme de dentes decíduos em pacientes com cárie severa na infância através da análise de PCR-DGGE e verificar a ação de agentes antimicrobianos sobre bactérias prevalentes nesse tipo de lesão. Foram coletadas amostras de biofilme bacteriano provenientes de dentes hígidos (G1), com lesão de cárie de esmalte (G2) e dentina (G3) de 23 crianças entre 1 ? 5 anos de idade. O DNA metagenômico foi extraído pelo o método de CTAB, a qualidade do DNA foi verificada em gel de agarose seguida de eletroforese, e a quantificação e pureza foi determinado espectrofotometricamente. Em seguida, a região V3 do gene rDNA 16S foi amplificada utilizando-se o DNA extraído e os iniciadores universais BA 338fGC e UN518r. A quantidade de amplicons foi analisada por PCR-DGGE utilizando gel de acrilamida:bisacrilamida seguida de eletroforese. A aquisição das imagens foi realizada com fotodocumentador. Foram obtidos 45 amplicons, nos quais foi observado que as estruturas de comunidades bacterianas dos grupos estudados apresentaram diferenças entre os pacientes e entre os grupos de dentes, onde houve um maior numero de amplicons nosdentes do G2 e G3 quando comparados ao G1 (p < 0,05). Para a verificação da ação do gás ozônio e da associação de fluoreto de sódio (NaF) com clorexidina (CHX) contra S.mutans, L. acidophilus e E. faecalis foi utilizado a análise de recuperação de unidades formadoras de colônia (UFC/mL) em placas com ágar (TSA/SB) após o tratamento, e para os testes da associação do NaF e CHX foram verificadas por meio de análise da densidade ótica em placas de microtitulação de 96 poços. Os dados obtidos do tratamento com ozônio foram submetidos aos testes de Wilcoxon (p<0,05), ANOVA e Tukey (p<0,05). Para os dados de NaF-CHX foram aplicados os testes de ANOVA 2-way e Bonferroni (p<0,05). A contagem de UFC/mL demonstrou morte > 3log10 (99,9%) para todas as bactérias em uma aplicação de ozônio = 20ppm para S. mutans e = 200ppm para L. acidophilus e E. faecalis, enquanto que a associação de NaF-CHX foi mais eficaz (p<0,001) em todos as bactérias testadas quando comparado com as análises das substância isoladamente e ao grupo controle. Para este estudo in vitro pode-se concluir que a estrutura da comunidade bacteriana é mais complexa em dentes cariados, e o métodos de PCR-DGGE do gene rDNA 16S foi comprovado por ser uma ferramenta bastante valiosa para diferenciar a composição microbiana do biofilme dental. Todos os agentes antimicrobianos testados foram eficazes no controle do crescimento bacteriano de S. mutans, L. acidophilus e E. faecalis. <br>

Abstract : The objective of this research was to evaluate the structure of bacterial community from biofilms of deciduous teeth in patients with early childhood caries through the analysis of PCR ? DGGE; verify the action of antimicrobial agents on bacteria related. Biofilm samples were collected from intact teeth (G1) , with enamel caries (G2) and dentin caries (G3) of 23 children aged 1-5 years. The metagenomic DNA was extracted by the CTAB method, the quality of the DNA was checked by electrophoresis, while quantification and purity were determined spectrophotometrically. Then, the DNA extracted associated to universal primers (BA 338fGC UN518r) were used to amplify the V3 region of the gene 16S rDNA. The amount of fragments was analyzed by PCR- DGGE using gel Acrylamide : bisacrylamide followed by electrophoresis. A total of forty-five amplicons were obtained, it was observed that the structures of bacterial communities of both groups showed differences between patients and between groups of teeth , where there was a higher number of amplicons in the biofilm of G2 and G3 compared to G1 ( p < 0.05). The method of analyzing recovery colony forming units (CFU / mL ) on agar plates (TSA/SB) was used to test the action ofozone gas and the association of sodium fluoride (NaF) with chlorhexidine (CHX) against S. mutans , L. acidophilus and E. faecalis. The data obtained from the ozone treatment were subjected to Wilcoxon (p< 0.05 ) , ANOVA and Tukey test (p< 0.05 ). For data CHX - NaF -tests were applied to 2 -way ANOVA and Bonferroni (p<0.05). The number of CFU/mL showed death > 3log10 ( 99.9 % ) for all bacteria on an application of ozone = 20ppm for S. mutans and = 200 ppm for L. acidophilus and E. faecalis , while the combination of CHX - NaF was effective (p<0.001) in all the bacteria tested when compared to analysis of substance alone and the control group. For this in vitro study it can be concluded that the bacterial community structure is more complex in decayed teeth, and methods of PCR - DGGE of 16S rDNA gene was proven to be a very valuable tool for differentiating the microbial composition of the biofilm. All antimicrobial agents tested were effective in controlling bacterial growth of S. mutans, L. acidophilus and E. faecalis.