Estudos de inibição de proteínas tirosina fosfatases de Mycobacterium tuberculosis e Yersinia enterocolitica, e caracterização de uma proteína serina/treonina fosfatase de Mycoplasma synoviae

Abstract

A fosforilação reversível de proteínas mediada por proteínas cinases e fosfatases tem uma função reguladora central em muitos processos celulares em eucariotos e procariotos. Especialmente, proteínas tirosina fosfatases (PTPs), que constituem uma família de enzimas de sinalização muito importante. Essas enzimas têm atraído grande interesse como uma nova classe de alvos terapêuticos, uma vez que diversas bactérias patogênicas, como Yersinia sp. e Mycobacterium tuberculosis, utilizam suas PTPs como fatores de virulência. Dessa forma, um dos objetivos deste trabalho foi a busca por compostos com ação inibitória de YopH de Yersinia enterocolitica e PtpA e PtpB de Mycobacterium tuberculosis em uma biblioteca de compostos orgânicos. Os compostos mais ativos frente à YopH foram duas sulfonamidas, K3 e K7, com valores de Ki de 36 ± 2,5 e 4,4 ± 0,4 ?M, e mecanismo de inibição não-competitivo e competitivo, respectivamente. Estudos de modelagem molecular do composto K7 indicaram que o mesmo estabelece contatos polares e hidrofóbicos com resíduos chave do sítio catalítico da YopH. Além disso, aproximadamente 351 compostos foram analisados frente à atividade da PtpA e PtpB. Destes, chalconas e produtos naturais apresentaram os melhores resultados, com afinidade de ligação na ordem micromolar. A chalcona CH6 inibiu de modo não-competitivo a PtpA, com Ki de 7,1 ± 1,0 ?M, e a PtpB, com Ki de 3,3 ± 0,7 ?M. Já os compostos naturais EUFR163 e EUFR592 e a chalcona B85 inibiram competitivamente a PtpA, com valores de Ki de 5,7 ± 0,8, 1,3 ± 0,3 e 2,9 ± 0,7 ?M, e a PtpB, com valores de Ki de 1,0 ± 0,4, 1,3 ± 0,1 e 3,3 ± 0,6 ?M, respectivamente. Proteínas serina/treonina fosfatases foram descritas em muitas bactérias patogênicas como enzimas essenciais nas vias de sinalização dependente de fosforilação, além de frequentemente estarem associadas à virulência desses organismos. As bactérias do gênero Mycoplasma são caracterizadas como os menores organismos com capacidade de autorreplicação e por um genoma muito reduzido, resultando na redução da sua capacidade codificante, na perda da parede celular e várias vias metabólicas. A análise do genoma do M. synoviae, patógeno de frangos e perus, revelou a presença de apenas um gene codificante de uma proteína Ser/Thr fosfatase da subfamília PP2C (prpC). Assim, o segundo objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização bioquímica dessa fosfatase, e em particular a função dos íons metálicos na relação estrutura-atividade. A análise da sequência de aminoácidos da PrpC revelou que todos os resíduos envolvidos no centro metálico binuclear, conservados em fosfatases PP2C, estão presentes em PrpC. Além disso, os resíduos que coordenam o terceiro metal no sítio ativo de PP2C bacterianas, também estão conservados na PrpC. A PrpC recombinante é uma proteína monomérica capaz de desfosforilar fosfo-substratos na presença de íons Mn2+. A análise de dicroísmo circular (CD) indicou uma mistura de estruturas ?-hélice e folha-?, e que a presença de íons Mn2+ não afetou o conteúdo de estrutura secundária da PrpC. Já a análise de estabilidade térmica por CD e fluorescência demonstrou que a enzima apresenta estabilidade a temperaturas moderadas e que esta característica é influenciada pela presença de metal. As análises de espectrometria de massa e calorimetria de titulação isotérmica indicaram a ligação de três íons metálicos à PrpC, dois com alta afinidade e um com baixa afinidade (milimolar). A mutagênese sítio-dirigida dos resíduos que coordenam o provável terceiro íon metálico, Asp122 e Arg164, revelou que as proteínas mutantes, assim como a proteína WT, foram capazes de se ligar ao terceiro íon metálico, e que ambas as mutações afetaram a atividade enzimática da PrpC. De acordo com esses resultados, a PrpC é um membro da família PPM, que apresenta maior estabilidade na presença de metal e com um terceiro sítio de ligação a metal essencial à atividade catalítica.<br>

Abstract : Protein phosphorylation mediated by protein phosphatases has a central regulatory function in many cellular processes in eukaryotes and prokaryotes. Specially protein tyrosine phosphatases (PTPs), that constitute a family of important signaling enzymes, have attracting interest as a new class of drug targets, once in some pathogenic bacteria, such as Yersinia sp. and Mycobacterium tuberculosis, the tyrosine phosphatases act as main virulence factors. In this context, one of the objectives of this work was the search for compounds with inhibitory activity of Yersinia enterocolitica YopH and Mycobacterium tuberculosis PtpA and PtpB on an in-house library. The most active compounds against YopH were two sulfonamides, K3 e K7, with Ki values of 36 ± 2.5 and 4.4 ± 0.4 ?M, respectively. Furthermore, these compounds were identified as non-competitive and competitive inhibitors of YopH, respectively. Molecular modeling investigations of the best YopH inhibitor (K7) indicated that this compound establishes polar and hydrophobic contacts with key residues of the YopH catalytic site. In addition, approximately 351 compounds were assayed against PtpA and PtpB, from these, chalcones derivatives and natural products showed the best results, with binding affinity in the low micromolar range. The chalcone CH6 was identified as non-competitive inhibitor of PtpA, with Ki value of 7.1 ± 1.0 ?M, and of PtpB, with Ki value of 3.3 ± 0.7 ?M. However, the natural compounds EUFR163 and EUFR592, and the chalcone B85 were identified as competitive inhibitors of PtpA, with Ki values of 5.7 ± 0.8, 1.3 ± 0.3 and 2.9 ± 0.7 ?M, and of PtpB, with Ki values of 1.0 ± 0.4, 1.3 ± 0.1 and 3.3 ± 0.6 ?M, respectively. Serine/threonine protein phosphatases have been described in many pathogenic bacteria as essential enzymes involved in phosphorylation-dependent signal transduction pathways, and frequently associated to the virulence of these organisms. Mycoplasmas, bacteria of the class Mollicutes, are characterized by a drastic genome downsizing, which during evolution lead up to current mycoplasmas having a reduced coding capacity, no cell wall, and a limited number of metabolic pathways. An inspection of M. synoviae genome, a common pathogen of chickens and turkeys, revealed the presence of a gene (prpC) encoding a putative protein serine/threonine phosphatase of the PP2C subfamily. Thus, the second objective of this work was report the complete biochemical characterization of M. synoviae phosphatase (PrpC), and the particular role of metal ions in the structure-function relationship of this enzyme. PrpC amino acid sequence analysis revealed that all the residues involved in the dinuclear metal center, conserved in PP2C phosphatases, are present in PrpC, and the putative third metal coordinating residues are also conserved, indicating that PrpC might bind to a third metal as other bacterial PP2C. Recombinant PrpC is a monomeric protein able to dephosphorylate phospho-substrates with Mn2+ ions dependence. Circular dichroism (CD) indicated a mixture of ?-helix and ?-sheet structure, and that PrpC secondary structure was not significantly altered in the presence of Mn2+ ions. Thermal stability analysis by CD and fluorescence spectroscopy demonstrated the enzyme stability at mild temperatures, and the influence of Mn2+ ions in this characteristic. Mass spectrometry and isothermal titration calorimetry analysis indicated three metals ions binding to PrpC, two of which with a high-affinity constant, and one, with millimolar affinity. Mutational analysis of the possible third metal ion coordinating residues, Asp122 and Arg164, revealed that these variants were also able to bind to the third metal ion, and that both mutations affected PrpC phosphatase activity. According to these results, PrpC is, indeed, a PPM member with an improved stability and activity in the holo form, and with a third metal-binding site essential to catalytic activity.