Agmatina, um candidato à adjuvante da farmacoterapia da depressão: estudos in vitro e in vivo

Abstract

A agmatina é um neuromodulador, cuja atividade antidepressiva tem sido mostrada tanto em ensaios pré-clínicos como clínicos. Contudo, os mecanismos celulares e moleculares responsáveis por seu efeito não estão totalmente esclarecidos. Estudos dos últimos 40 anos têm demonstrado que episódios de estresse induzem anormalidades do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal e hipersecreção de glicocorticóides os quais estão implicados na fisiopatologia da depressão. O presente estudo verificou a habilidade da agmatina em: i) produzir um efeito antidepressivo no teste da suspensão pela cauda (TSC) após sua administração sub-crônica em camundongos e o envolvimento de vias de sinalização intracelular hipocampal; ii) abolir o comportamento tipo-depressivo no teste do nado forçado (TNF) e o desequilíbrio oxidativo hipocampal induzidos pelo estresse de contenção (EC) em camundongos; iii) proteger células neuronais hipocampais murinas HT22 frente à citotoxicidade induzida pela corticosterona e o envolvimento do fator de transcrição Nrf2; iv) abolir o comportamento tipo-depressivo no TSC e anedônico no splash teste, induzidos pela corticosterona em camundongos e a participação dos sistemas monoaminérgicos, do fator neurotrófico derivado do encéfalo (BDNF), da proteína sináptica sinaptotagmina I (Syt I), das células neurogliais e do fator de transcrição Nrf2. O tratamento sub-crônico com agmatina (0,01 e 0,1 mg/kg, p.o.) produziu um efeito antidepressivo no TSC sem afetar a atividade locomotora dos animais. Adicionalmente, a agmatina (0,001-0,1 mg/kg, p.o.) aumentou a fosforilação de substratos da proteína cinase A (PKA), a fosforilação da proteína cinase B (PKB)/Akt (Ser473), da enzima glicogênio sintase cinase-3ß (GSK-3ß) (Ser9), da cinase regulada por sinal extracelular 1/2 (ERK1/2), da proteína de ligação responsiva ao AMP cíclico (AMPc) (CREB) (Ser133) e o conteúdo de BDNF de uma maneira dose-dependente no hipocampo. Agmatina (0,001-0,1 mg/kg, p.o.) também reduziu a fosforilação da c-Jun N-terminal cinase 1/2 (JNK1/2). A fosforilação da proteína cinase C (PKC) e de p38MAPK não foi alterada em nenhuma condição experimental. Em relação ao modelo de EC em camundongos, este protocolo induziu um comportamento tipo-depressivo no TNF, peroxidação lipídica, aumento da atividade hipocampal das enzimas superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GPx) e glutationa redutase (GR), reduziu a atividade da catalase (CAT) e aumentou a razão SOD/CAT, um índice de condições pró-oxidativas, mas não afetou os níveis de glutationa reduzida. Agmatina (10 mg/kg, p.o.)aboliu o comportamento tipo-depressivo induzido pelo EC e preveniu a peroxidação lipídica e as alterações nas atividades de SOD, GR e CAT na razão SOD/CAT induzidas pelo EC. Na linhagem de células neuronais hipocampais murinas HT22, o tratamento com agmatina (10 µM) aboliu a produção de espécies reativas de oxigênio e a apoptose induzidas pela corticosterona, de uma maneira dose e tempo-dependentes. A combinação de concentrações sub-efetivas de agmatina e fluoxetina ou imipramina produziu um efeito citoprotetor sinérgico. O efeito neuroprotetor da agmatina foi abolido por ioimbina (antagonista de receptor a2-adrenérgico), cetancerina (antagonista de receptor 5-HT2A), LY294002 (inibidor de PI3K), PD98059 (inibidor de MEK1/2), SnPP (inhibitor da enzima hemoxigenase-1, HO-1) e cicloheximida (inibidor da síntese protéica). Agmatina também aumentou a fosforilação de Akt e de ERK e induziu translocação nuclear de Nrf2 bem como a expressão de HO-1 e da subunidade catalítica da enzima glutamato cisteína ligase (GCLc); a indução dessas proteínas foi abolida por ioimbina, cetanserina, LY294002 e PD98059. Por último, utilizando camundongos Swiss, o tratamento por 21 dias com agmatina (0,1 mg/ kg, p.o) preveniu, de maneira similar ao antidepressivo clássico imipramina, o comportamento tipo-depressivo no TSC e anedônico induzidos pela corticosterona. Além disso, agmatina aumentou os níveis hipocampais de noradrenalina, serotonina (5-HT), e dopamina tanto nos animais controle como nos tratados com corticosterona; e ainda preveniu a diminuição de 5-HT e o aumento de glutamato induzidos pela corticosterona. A agmatina aumentou a fosforilação de CREB nos animais controle; o imunoconteúdo de BDNF maduro (BDNFm), reduziu o conteúdo de BDNF imaturo (pro-BDNF), aumentou a razão BDNFm/pro-BDNF e o conteúdo de Syt I, de HO-1 e de GCLc tanto nos animais controle como nos tratados com corticosterona. Adicionalmente, o tratamento com agmatina foi capaz de prevenir a redução do conteúdo de BDNFm e de Syt I, e a retração e diminuição da quantidade de células astrogliais e microgliais em CA1 hipocampal induzidas pela corticosterona. Agmatina produziu um efeito antidepressivo nos camundongos C57BL/6 Nrf2 (+/+) no TSC e splash teste, mas não nos animais Nrf2 (-/-). O presente estudo ampliou de maneira significativa o conhecimento dos mecanismos celulares e moleculares implicados no efeito antidepressivo da agmatina através de ensaios in vitro e in vivo. Nosso conjunto de resultados indica que o efeito antidepressivo da agmatina parece ser mediado pela sua atuação sobre as principais hipóteses que explicam a fisiopatologia da depressão e terapia antidepressiva: monoaminérgica, neurotrófica, oxidativa eglutamatérgica, indicando seu potencial como adjuvante/monoterapia para o tratamento da depressão.<br>

Abstract: Agmatine is an endogenous neuromodulator, whose antidepressant activity has been shown in preclinical and clinical trials. However, the cellular and molecular mechanisms implicated in its effect are not entirely clarified. Studies over the last 40 years have shown that episodes of stress induce abnormalities in the hypothalamic-pituitary-adrenal axis and hypersecretion of glucocorticoids which are implicated in the pathophysiology of major depression. The present study verified the agmatine's ability to: i) produce an antidepressant-like effect in the tail suspension test (TST) followed its sub-chronic administration in mice and the involvement of hippocampal intracellular signaling pathways in such effect; ii) abolish the depressive-like behavior in the forced swimming test (TNF) and hippocampal antioxidant imbalance induced by acute restraint stress (ARS) in mice; iii) protect HT22 mouse hippocampal cells against the corticosterone-induced cytotoxicity and the involvement of the transcription factor Nrf2 in such effect; iv) abolish the depressive-like behavior in the TST, and anhedonic behavior induced by corticosterone and the involvement of the monoaminergic systems, brain-derived-neurotrophic factor (BDNF), synaptic protein synaptotagmin I (Syt I), neuroglial cells and the transcription factor Nrf2 in such effect. The sub-chronic agmatine (0.01 and 0.1 mg/kg, p.o.) administration produced a significant antidepressant-like effect in the TST and no locomotor effect in mice. Additionally, agmatine (0.001-0.1 mg/kg, p.o.) increased the phosphorylation of protein kinase A (PKA) substrates, protein kinase B (PKB)/Akt (Ser473), glycogen synthase kinase-3ß (GSK-3ß) (Ser9), extracellular signal-regulated kinases 1/2 (ERK1/2) and cAMP response elements (CREB) (Ser133), and BDNF immunocontent in a dose-dependent manner in the hippocampus. Agmatine (0.001-0.1 mg/kg, p.o.) also reduced the c-jun N-terminal kinase 1/2 (JNK1/2) phosphorylation. Neither protein kinase C (PKC) nor p38MAPK phosphorylation was altered under any experimental conditions. Regarding ARS protocol, it caused a depressive-like behavior in the FST, hippocampal lipid peroxidation, and an increase in the activity of hippocampal superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione reductase (GR) activities, reduced catalase (CAT) activity and increased SOD/CAT ratio, an index of pro-oxidative conditions, but did not affect reduced glutathione levels. Agmatine (10 mg/kg, p.o.) was effective to abolish the depressive-like behavior induced by ARS and to prevent the ARS-induced lipid peroxidation and changes in SOD, GR and CAT activities and inSOD/CAT activity ratio. In HT22 hippocampal neuronal cell line, corticosterone induced apoptotic cell death and increased reactive oxygen species production, effects that were abolished in a concentration- and time-dependent manner by agmatine (10 µM) treatment. The combination of sub-effective concentrations of agmatine with fluoxetine or imipramine afforded synergic protection. The neuroprotective effect of agmatine was abolished by yohimbine (a2-adrenoceptor antagonist), ketanserin (5-HT2A receptor antagonist), LY294002 (PI3K inhibitor), PD98059 (MEK1/2 inhibitor), SnPP (heme oxygenase-1 (HO-1) inhibitor), and cycloheximide (protein synthesis inhibitor). Agmatine increased Akt and ERK phosphorylation, and induced the transcription factor Nrf2 and the proteins HO-1 and glutamate cysteine ligase, catalytic subunit (GCLc); induction of these proteins was prevented by yohimbine, ketanserin, LY294002 and PD98059. Finally, in Swiss mice, the depressive-like behavior in the TST and the anhedonic behavior induced by corticosterone were prevented by agmatine (0.1 mg/kg, po) treatment for 21 days, similarly to the classical antidepressant imipramine. Additionally, agmatine increased the hippocampal levels of noradrenaline, serotonin (5-HT) and dopamine in the both control group and corticosterone-treated mice; and also prevented the decreased 5-HT and increased glutamate levels induced by corticosterone. Agmatine induced an increase in CREB phosphorylation in control mice as well as an increase in the mature BDNF (BDNFm), reduction in the immature BDNF (pro-BDNF) immunocontents, increase in the BDNFm/pro-BDNF ratio, and in the Syt I, HO-1 and GCLc immunocontents in the both control and corticosterone-treated mice. Additionally, agmatine treatment was able to prevent the reduction in the immunocontent of BDNFm and Syt I and the atrophy and reduction of astroglial and microglial cells in CA1 hippocampal induced by corticosterone. Agmatine produced an antidepressant-like effect in C57BL/6 Nrf2 (+/+) mice in the TST and splash test, but not in Nrf2 (-/-) mice. The present study extends the available data on the cellular and molecular mechanisms that underlie the antidepressant effect of agmatine by using in vitro and in vivo approachs. Taken together, our results show that the antidepressant effect of agmatine appears to be mediated by its effect on the key hypotheses that explain the pathophysiology of depression and antidepressant therapy: monoaminergic, neurotrophic, oxidative, and glutamatergic, indicating its potential to be used as adjuvant/monotherapy in the management of major depression.