Calos de passifloras silvestres: indução, caracterização morfo-histológica, metabólica e ultraestrutural

Abstract

Passiflora setacea e P. tenuifila são espécies silvestres de maracujás endêmicas do Brasil, com importantes propriedades medicinais. A P. setacea apresenta também potencial para o mercado consumidor devido à qualidade de seus frutos e a P. tenuifila tem sido indicada para o melhoramento genético. A produção de metabólitos secundários via cultura de tecidos in vitro tem sido investigada como uma alternativa à utilização de plantas produzidas no campo, pois oferece ferramentas para promover a otimização da produção. Assim, os objetivos deste estudo foram: analisar a histologia de calos de P. setacea induzidos em 2,4-D; determinar efeitos de diferentes concentrações de ANA e fontes de Carbono, quanto à morfo-histologia, ultraestrutura e teores de metabólitos de calos de P.tenuifila e; caracterizar, com base na ultraestrutura, como a Matriz Extracelular (ME) determina a desintegração das células dos calos friáveis de espécies de Passilfora. Para o estudo sobre indução e histologia, amostras de calos de P. setacea e P. tenuifila, obtidos a partir de diferentes tipos de explantes e meios de cultivo in vitro, foram fixadas em glutaraldeído 2,5% com tampão fosfato de sódio 0,1M, pH 7,2 e desidratadas. Para MO, amostras foram infiltradas em hidroxietilmetacrilato, seccionadas em micrótomo, coradas com azul de toluidina ou submetidas à reação com vermelho de rutênio, para identificar substâncias pécticas. Para análise em MEV, amostras foram secas em ponto crítico de CO2 e, para análise em MET, amostras de calos de P.tenuifila foram pós-fixadas em tetróxido de ósmio, infiltradas em resina Spurr, seccionadas em ultramicrótomo, contrastadas com Acetato de Uranila e Citrato de Chumbo. Calos de P. tenuifila com 45 dias foram coletados para determinar: percentagem de explantes que induziram calos, teor de água, acúmulo de biomassa, análise de metabólitos, atividade antioxidante por DPPH e a dosagem de clorofila. A percentagem mais elevada de explantes que formaram calos de P. setacea foi observada em 2,5 e 5,0 µM de 2,4-D. Calos obtidos a partir de segmentos de hipocótilo em 5,0 µM de 2,4-D e de segmento nodal foliar em 2,5 µM de 2,4-D mostraram características histológicas indicando grande potencial para morfogênese e produção de metabólitos secundários. Em estudo com calos de P. tenufila, todas as fontes de carbono e concentrações de ANA permitiram altas22percentagens de produção de calos, sem diferenças entre os tratamentos. Todos os calos apresentaram textura friável e características histológicas similares. Compostos fenólicos, flavonóides e carotenóides (luteína, zeaxantina e a-caroteno) foram detectados em calos de P. tenuifila. Atividade antioxidante não foi registrada. As características histológicas observadas sugerem que os calos de P.tenuifila, com 45 dias de cultivo, estavam em estádio inicial. No estudo sobre a ME verificamos sua constituição péctica. A superfície dos calos estava revestida com ME membranosa, com aspecto liso externamente e granular ou fibrilar internamente. O aspecto granular ou fibrilar decorre da desconexão entre células. A presença de golgi, vesículas na periferia da célula e evidências da liberação de substâncias e dissociação intercelular foram registradas ultraestruturalmente e sugerem que a consistência friável dos calos de Passiflora é resultante da desconexão das células periféricas.<br>

Abstract : Passiflora setacea and P. tenuifila are wild species of endemic passion fruit in Brazil, with important medicinal properties. P. setacea has also potential for the consumer market due to the quality of its fruit and P. tenuifila has been used for the genetic improvement. The production of secondary metabolites through in vitro tissue culture has been investigated as an alternative to the use of plants produced in the field, it provides tools for promoting the production optimization. The objectives of this study were to analyze the histology of P. setacea callus induced in 2,4-D; examine the effects of different concentrations of NAA and carbon sources in the morphological- histology, ultrastructure and level of metabolites in P.tenuifila callus and; to characterize, based on ultrastructure, how the Extracelular Matrix (EM) determines the disintegration of cells in friable callus of Passilfora species. For the study of induction and histology, samples of P. tenuifila and P. setacea callus, obtained from differents types of explants and in vitro culture media were fixed in 2.5% glutaraldehyde in sodium phosphate buffer 0, 1M, pH 7.2 and dried. For OM, the samples were infiltrated in methacrylate, sectioned with a microtome, stained with toluidine blue or subjected to reaction with ruthenium red to identify pectic substances. For SEM analysis, samples were dried in a critical point of CO2, and for TEM analysis, samples P.tenuifila callus were post-fixed in osmium tetroxide, infiltrated in Spurr resin, sectioned with ultramicrotome, contrasted with uranyl acetate and lead citrate. P.tenuifila calllus were collected with 45 days to determine: percentage of explants that to induced callus, water content, biomass accumulation, analysis of metabolites, antioxidant activity and measurement of chlorophyll. The highest percentage of explants that to induced P. setacea callus was observed at 2.5 and 5.0 uM of 2,4-D. Callus from hypocotyl segment in 5.0 µM 2,4-D and from leaf nodal segment in 2.5 µM 2,4-D showed histological characteristics indicate great potential for morphogenesis and secondary metabolite production. In the study with P. tenufila callus, all sources of carbon and NAA concentrations allowed high induction percentages, without differences between treatments. All callus showed friable texture and similar histological characteristics. Phenolic compounds, flavonoids and carotenoids (lutein, zeaxanthin and a-carotene) were detected in P. tenuifila callus.24Antioxidant activity wasn`t recorded. The histological characteristics suggest that P.tenuifila callus with 45 days were in inicial stage. In the study about the EM we found your pectic constitution. The surface of the callus was coated with EM membranous, with smooth appearance externally and granular or fibrillar internally. The granular or fibrillar aspect stems from the disconnect between cells. The presence of Golgi, vesicles at the periphery of the cell and evidence of release of substances and intercellular dissociation were recorded by ultrastructure study and suggest that the Passiflora friable callus is the result of disconnection of peripheral cells.