Modelagem do crescimento de bactérias ácido lácticas em cultura pura e mista sob condições isotérmicas e não isotérmicas de cultivo

Abstract

As bactérias ácido lácticas (BAL), Lactobacillus plantarum, Weissella viridescens e Lactobacillus sakei, estão entre as principais bactérias deteriorantes dos produtos cárneos refrigerados, embalados a vácuo e em atmosfera modificada e o conhecimento da cinética de crescimento, considerando a variação da temperatura, das culturas puras e da cultura mista dessas três BAL, possibilitam uma simulação das possíveis condições de contaminação que ocorrem nos produtos cárneos. O objetivo deste trabalho foi modelar o crescimento de BAL em cultura pura e mista sob condições isotérmicas e não isotérmicas de cultivo, em meio de cultura. Para a construção das curvas de crescimento das BAL foi estudada a associação dos métodos de plaqueamento e medidas de absorbância. Foram realizados testes com L. plantarum, referentes à influência de cinco diferentes concentrações de inóculo (de 103 a 107 UFC.mL-1) sobre a fase lag (?), a velocidade específica máxima de crescimento (µmáx) e o aumento logarítmico da população (A). O parâmetro ? foi o único influenciado pelo nível do inóculo, quando foi utilizado o método de absorbância, pois o seu limiar de detecção é de 106-107 UFC.mL-1. Para evitar o efeito observado sobre o ? foi utilizado um modelo de correlação entre os valores de absorbância e contagem por plaqueamento para converter a leitura de absorbância em UFC.mL-1 quando necessário. Esta associação de métodos foi validada com dados experimentais, possibilitando a obtenção de curvas de crescimento de BAL de forma confiável e menos trabalhosa. Utilizando-se o modelo de correlação definido, o crescimento isotérmico das culturas puras das BAL em meio de cultivo foi avaliado às temperaturas de 4, 8, 12, 16, 20 e 30 ºC e concentração inicial de inóculo de 103 UFC.mL-1. Os modelos de Baranyi e Roberts (BAR) e Gompertz (GO) foram ajustados às curvas de crescimento das três BAL e o modelo de BAR apresentou o melhor ajuste, sendo escolhido para determinar l, µmáx e população máxima atingida (Nmáx) das três BAL. Os modelos da raiz quadrada e tipo Arrhenius descreveram a influência da temperatura sobre µmáx e Nmáx das três BAL. O modelo da potência descreveu a influência da temperatura sobre l para L. plantarum e as demais bactérias não apresentaram fase lag. Em seguida, duas culturas mistas (CM) foram estudadas, CM 1 composta pela mistura das cepas das três BAL e avaliada nas temperaturas de 20 e 30 ºC, e CM 2 composta pela mistura das cepas de W. viridescens e L. sakei e avaliada na temperatura de 30 ºC. As curvas de crescimento de CM 1 e CM 2 foram construídas utilizando o método de contagem por plaqueamento em função do tempo e concentração inicial de inóculo de 103 UFC.mL-1. Os modelos de BAR e GO foram ajustados às curvas de crescimento de CM 1 e CM 2 e o modelo de BAR apresentou um ajuste ligeiramente melhor para estas duas culturas mistas nas duas temperaturas de incubação estudadas, sendo escolhido para a definição de ?, µmáx e Nmáx destas culturas. A variação da temperatura de incubação e o tipo de cultura mista utilizados influenciaram ? e µmáx, mas não foi observada alteração no Nmáx. Estes resultados geraram a hipótese de que a retirada de L. plantarum da CM 2 poderia ter provocado estas alterações em ? e µmáx. No entanto, a influência de L. plantarum no crescimento das outras duas bactérias não pode ser identificada pelo método de plaqueamento ou pelo método de medidas de absorbância, devido ao fato destas possuírem a mesma morfologia e com isso apresentam resultados idênticos quando são quantificadas pelos métodos convencionais. A partir disto, a técnica de reação em cadeia de polimerase quantitativa (qPCR) surge como uma alternativa para quantificar e diferenciar, individualmente, a cinética de crescimento de cada uma das BAL presentes na cultura mista. Contudo, não foi possível quantificar as BAL estudadas pela técnica de qPCR, pois não houve o tempo necessário para otimizar a técnica de acordo com as exigências deste trabalho. Finalizando, foram realizados cultivos não isotérmicos de L. plantarum e da CM 1 a fim de estudar o comportamento das BAL numa variação de temperatura. As curvas de crescimento não isotérmico foram construídas utilizando o método de contagem por plaqueamento em função do tempo. A predição do crescimento não isotérmico de L. plantarum, utilizando os modelos BAR e GO, foi desenvolvida para os perfis de temperatura crescente de 12 até 20 ºC e decrescente de 20 até 12 ºC. Já a predição do crescimento não isotérmico da CM 1, utilizando os modelos BAR e GO, foi desenvolvida para o perfil de temperatura decrescente de 30 até 20 ºC. O modelo não isotérmico de BAR apresentou melhor capacidade preditiva para os dois perfis de temperatura de L. plantarum e para o perfil de temperatura da CM 1 estudados. Na validação do crescimento não isotérmico da CM 1 evidenciou-se a possibilidade de duas espécies de BAL (W. viridescens e L. sakei) estarem predominando na cultura mista. A investigação desta hipótese poderia ser realizada através da técnica de qPCR. De acordo com todos os resultados apresentados, o crescimento das BAL foi fortemente influenciado pela temperatura de armazenamento e os modelos obtidos permitiram predizer o crescimento destas bactérias dentro da faixa de temperatura testada.<br>

Abstract : The lactic acid bacteria (LAB), Lactobacillus plantarum, Weissella viridescens and Lactobacillus sakei, are among the main spoilage bacteria of chilled meat products packaged in vacuum and modified atmosphere as well as the knowledge of the growth kinetics considering the variation of the temperature, pure cultures and mixed cultures of these three LAB enable a simulation of the possible conditions of contamination occurring in meat products. The objective of this study was to model the growth of LAB in pure culture and mixed under isothermal and non-isothermal conditions of cultivation in the culture medium. For the construction of the growth curves of LAB, the association of plate count methods and absorbance measurements was studied. Tests were carried out with L. plantarum, referring to the influence of five different inoculum concentrations (103-107CFU.mL-1) on the lag phase (?), the maximum specific growth rate (µmax) and the logarithmic increase in population (A). The parameter ? was the only influenced by the inoculum level when it was used the absorbance method because their detection threshold is 106-107 CFU.mL-1. To prevent the observed effect on ?, we used a model of correlation between the absorbance measurements and plate count methods for converting the absorbance measurements for CFU.mL-1 when necessary. This combination of methods has been validated with experimental data, making it possible to obtain growth curves of LAB reliable and less burdensome way. Using the defined correlation model, the isothermal growth of pure cultures of LAB in culture medium was evaluated at temperatures of 4, 8, 12, 16, 20 and 30 °C and initial inoculum concentration 103CFU.mL-1. The Baranyi and Roberts (BAR) and Gompertz (GO) models were adjusted to the growth curves of the three LAB and the BAR model showed the best fit, being chosen to determine l, µmax and maximum population (Nmax) of the three LAB. The models of the square root and Arrhenius type described the influence of temperature on µmax and Nmax the three LAB. The model power described the influence of temperature on ? to L. plantarum and other bacteria showed no lag phase. Then, two mixed cultures (CM) were studied, CM 1 composed of the mixture of the three strains LAB and evaluated in the 20 and 30 ºC, and CM 2 composed of the mixture of strains W. viridescens and L. sakei and evaluated the temperature 30 °C. Growth curves CM 1 and CM 2 were constructed using plate count method a function of time and initial inoculum concentration of 103CFU.mL-1. BAR and GO models were adjusted to the growth curves CM 1 and CM 2 and BAR model showed a slightly better fit for these two mixed cultures at both incubation temperatures studied, being chosen for the definition of ?, µmax and Nmax these cultures. The variation of incubation temperature and the type of mixed culture influenced ? used and µmax, but no change was observed in Nmax. These results led to the hypothesis that the removal of L. plantarum CM 2 could have caused these changes in ? and µmax. However, the influence on the growth of L. plantarum bacteria of the other two cannot be identified by the plate count method or absorbance measurements due to the fact that these have the same morphology and therefore have identical results when quantified by the conventional methods. From this, the reaction technique of quantitative polymerase chain reaction (qPCR) is an alternative for quantifying and differentiating individually, the growth kinetics of each LAB present in the mixed culture. However, it was not possible to quantify the LAB analyzed by qPCR, since there was not enough time, necessary to optimize the technique, according to the requirements of this study. Finally, non-isothermal growth were performed L. plantarum and CM 1 in order to study the behavior of BAL in a temperature range. The growth curves were constructed using non-isothermal plate count method a function of time. The prediction of the non-isothermal growth of L. plantarum, using the BAR and GO models, was developed for increasing temperature profile of 12 to 20 °C and decreasing to 20 to 12 °C. Since the prediction of growth of non-isothermal CM 1, using the BAR and GO model, was developed for the decreasing temperature profile of 30 to 20 °C. The non-isothermal BAR model showed better predictive ability for the two L. plantarum temperature profiles and the temperature profile of the CM 1 studied. Validation of non-isothermal growth of CM 1 showed the possibility of the two species of LAB (W. viridescens and L. sakei) being predominating in the mixed culture. The investigation of this hypothesis could be performed by qPCR technique. According to all presented results, the growth of LAB was strongly influenced by storage temperature and the obtained models enabled to predi growth of these bacteria within the tested temperature range.