Produção de biossurfactante por Bacillus subtilis ATCC 21332 em condição anaeróbia

Abstract

Biossurfactantes são compostos anfifílicos de origem biológica que possuem capacidade de reduzir a tensão superficial e interfacial. Dentre os mais efetivos estão os lipopeptídeos produzidos por bactérias do gênero Bacillus, especialmente a surfactina. Devido aos seus altos custos de produção sua aplicação ainda é limitada, tornando-se necessário processos que viabilizam economicamente sua produção. A produção de surfactina a partir de processos anaeróbios pode servir como uma alternativa na redução dos custos operacionais e estruturais. Além disso, microrganismos com capacidade de sintetizar surfactina em anaerobiose são de interesse da indústria petroquímica, pois ambos, surfactina e microrganismo podem ser empregados na extração do petróleo a partir de poços esgotados. Este trabalho teve como objetivo realizar o estudo cinético da produção do biossurfactante surfactina por Bacillus subtilis ATCC 21332 em condição anaeróbia. Todos os ensaios foram realizados em biorreator operado de forma descontínua, em meio salino baseado na composição da água do mar (meio MM), acrescido de glicose e de NaNO3 como fontes de carbono e nitrogênio, respectivamente, além de outros micronutrientes. Inicialmente, para efeito comparativo, B. subtilis foi cultivado na presença e na ausência de oxigênio, em meio MM contendo 10 g.L-1 de glicose e 4,25 g.L-1 de NaNO3. Os resultados mostraram que a presença de oxigênio favoreceu a síntese de surfactina, resultando em maior produtividade, 4,92 mg.L-1.h-1, em comparação ao anaeróbio, 1,84 mg.L-1.h-1. Os cultivos com diferentes relações carbono/nitrogênio (C/N) no meio MM, foram realizados com 10 g.L-1 de glicose e diferentes concentrações de NaNO3. Das condições testadas, a que se mostrou mais adequada foi a relação C/N 3,6, resultando em produção de 49,7 mg.L-1 e produtividade de 2,49 mg.L-1.h-1 em surfactina. A partir desta foram realizados dois cultivos no meio MM aumentando-se proporcionalmente as fontes de carbono e nitrogênio. A produtividade média de 1,75 mg.L-1.h-1 de surfactina, obtida nos cultivos contendo 15 e 20 g.L-1 de glicose foi inferior à produtividade alcançada com 10 g.L-1 de glicose, mostrando que houve efeito negativo com o aumento das concentrações. Avaliou-se também a produtividade em surfactina quando B. subtilis foi cultivado no meio mineral adicionado de micronutrientes (MM1) e de micronutrientes suplementado com 1 g.L-1 de extrato de levedura(MM2), acrescido de 20 g.L-1 de glicose. A maior produção de 101,8 mg.L-1 e a maior produtividade de 3,39 mg.L-1.h-1 em surfactina foram obtidas utilizando o meio MM2. Quando se avaliou a influência do aumento proporcional das fontes de carbono e de nitrogênio no MM2, os resultados mostraram efeito negativo sobre a produtividade emsurfactina a partir do aumento na concentração de glicose. A produtividade foi de 3,18 mg.L-1.h-1 e 1,63 mg.L-1.h-1 de surfactina, nos cultivos contendo 30 e 40 g.L-1 de glicose, respectivamente. Os resultados mostraram que a maior produtividade em surfactina (3,39 mg.L-1.h-1) foi obtida cultivando B. subtilis ATCC 21332 em biorreator anaeróbio no meio MM2 contendo 20 g.L-1 de glicose. As velocidades específicas de crescimento (µX), de consumo de substrato (µS) e de produção de biossurfactante (µP) correlacionaram-se bem, podendo-se então afirmar que a surfactina produzida por Bacillus subtilis ATCC 21332 está associada ao crescimento celular. A análise de espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) confirmou que o biossurfactante produzido é um lipopeptídeo do tipo surfactina. A surfactina semipurificada se mostrou efetiva e eficaz, pois apresentou CMC de 10 mg.L-1 e foi capaz de reduzir a tensão superficial da água de 72,0 para 29,9 mN.m-1. A solução aquosa de surfactina exibiu excelente capacidade emulsificante e estabilidade das emulsões formadas e, apresentou estabilidade na faixa de pH entre 6 e 8, salinidade de até 10 % de NaCl e tempo de exposição de 140 min a 100 °C.<br>

Abstract : Biosurfactants are amphiphilic compounds that have the ability to lower the surface and interfacial tension. Among the most effective biosurfactants are the lipopeptides produced by Bacillus, especially the surfactin. Due to their high production costs, its implementation is still limited, making necessary processes that economically allow its production. The production of surfactin from anaerobic processes can serve as an alternative in reduction of operational and structural costs. In addition, microorganisms capable of synthesizing surfactin anaerobically are interesting for petrochemical industry since both, surfactin and microorganism can be employed in the extraction of oil from depleted wells. This study aimed to perform a kinetic study of the production of surfactin by Bacillus subtilis ATCC 21332 in anaerobic conditions. All assays were performed in a bioreactor operated discontinuously, in saline medium based on the composition seawater (MM medium) supplemented with NaNO3 and glucose as carbon and nitrogen sources, respectively, and other micronutrients. Initially, for comparative purposes, B. subtilis was cultivated with and without oxygen, in MM medium containing 10 g.L-1 of glucose and 4.25 g.L-1 of NaNO3. Results showed that the presence of oxygen favored the surfactin synthesis, resulting in higher productivity, 4.92 mg.L-1.h-1, compared to the anaerobic process that was 1.84 mg.L-1.h-1. Cultures with different carbon/nitrogen (C/N) ratio in MM medium were performed at 10 g.L-1 glucose and different concentrations of NaNO3. Among the tested conditions, the C/N 3.6 had the best result, resulting in surfactin production and productivity of 49.7 mg.L-1 and 2.49 mg L-1.h-1, respectively. Based on these results, two cultures were performed in MM medium by increasing proportionally carbon and nitrogen concentrations. Average productivity in surfactin of 1.75 mg.L-1.h-1, that was obtained in the culture containing 15 and 20 g.L-1 glucose was lower than the productivity achieved with 10 g.L-1 of glucose, showing that there was a negative effect of increasing concentrations. It also evaluated the productivity of surfactin whenB. subtilis was grown on mineral medium supplemented with micronutrients (MM1) and added micronutrients and supplemented with 1 g.L-1 yeast extract (MM2) plus 20 g.L-1 glucose. The highest production of surfactin of 101.8 mg.L-1 and the highest productivity of 3.39 mg.L-1.h-1 were obtained usingMM2 medium. When it was evaluate the influence of the proportional increase of carbon and nitrogen sources in MM2, results showed negative effect on the surfactin productivity. The surfactin productivity was 3.18 mg.L-1.h-1 and 1.63 mg.L-1.h-1, in cultures containing 30 and 40 g.L-1 glucose, respectively. The results showed that the greater surfactin productivity (3.39 mg.L-1.h-1) was obtained by cultivating B. subtilis ATCC 21332 in an anaerobic bioreactor using MM2 as medium containing 20 g.L-1 glucose. From the specific growth rates (µX), substrate consumption (µS) and biosurfactant production (µP) data, it can be said that the surfactin produced by Bacillus subtilis ATCC 21332 its associated with cell growth. Analysis of Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) confirmed that the biosurfactant produced in this work is surfactin. The semi purified surfactin was effective and efficient, since it presented a CMC of 10 mg.L-1 and was able to reduce the surface tension of water from 72.0 to 29.9 mN.m-1. The aqueous solution of surfactin showed excellent emulsifying capacity and stability of emulsions formed and was stable in the pH range between 6 and 8, salinity up to 10 % NaCl and exposure time of 140 min at 100 °C.