Aproveitamento de subprodutos da indústria de biocombustíveis para produção de poli(3-hidroxibutirato) por Ralstonia eutropha

Abstract

Os poli(hidroxialcanoatos) (PHAs) são compostos biodegradáveis, produzidos por microrganismos como reserva de energia, que despertam interesse industrial por serem termoplásticos biodegradáveis. O desenvolvimento de processos de produção desses biopolímeros de forma eficiente, tem sido foco de diversas linhas de pesquisa. Ralstonia eutropha é um dos microrganismos mais estudados para a produção de Poli(3-hidroxibutirato) (P(3HB)), que é o PHA mais comumente estudado. A utilização de substratos de baixo custo, como os resíduos, pode ser uma alternativa na redução dos custos de produção desses materiais. A vinhaça é o principal subproduto da indústria sucroenergética, sendo produzida em grandes volumes. A valorização da vinhaça, pelo desenvolvimento de um processo para obtenção de um produto com valor agregado, como o P(3HB), contribui com valor adicional à produção de etanol. O glicerol é uma das principais fontes de carbono presentes na vinhaça. O objetivo deste trabalho foi utilizar a vinhaça como substrato para o crescimento e a produção de P(3HB) pela bactéria R. eutropha DSM 545. Diferentes diluições de vinhaça foram estudadas e em nenhuma delas a bactéria sofreu inibição em seu crescimento, mesmo quando a vinhaça (sem diluição) foi apenas adicionada de sais. Visto que a bactéria alcançou a fase estacionária de crescimento quando havia substratos disponíveis no meio, como o glicerol, foi proposto realizar o melhoramento de R. eutropha DSM 545 para o consumo mais eficiente dessa fonte de carbono. Assim, dois dos genes responsáveis pelo consumo do glicerol em Escherichia coli: glpF e glpK, que codificam uma aquaporina e a glicerol quinase (atua na fosforilação do glicerol a glicerol 3-fosfato), respectivamente, foram expressos em R. eutropha DSM 545 (parental) e assim foi construída a cepa R. eutropha_glpFK (recombinante). Ao se analisar comparativamente o crescimento de R. eutropha_glpFK com R. eutropha DSM 545, em meio contendo glicose, os resultados mostraram que a expressão dos genes glpFK não interferiu no desempenho desse microrganismo. Cultivos em modo batelada em biorreator foram conduzidos para comparar o desempenho das cepas parental e recombinante, em glicerol, em vinhaça em meio contendo vinhaça adicionada de glicerol. Em vinhaça, a recombinante foi capaz de crescer com µmáx de 0,41 h-1, enquanto R. eutropha foi de 0,18 h-1. Nesses experimentos, não houve praticamente produção de biopolímero pois não ocorreu a limitação de um nutriente essencial. Nos ensaios conduzido sem vinhaça com adição de glicerol, a recombinante foi capaz de crescer com µmáx de 0,33 h-1 e acumulou 34% de P(3HB), enquanto R. eutropha foi de 0,19 h-1 e 15% de P(3HB). Ao comparar o crescimento das duas cepas, nos cultivos contendo glicerol como fonte de carbono, ambas foram capazes de acumular aproximadamente 35% de biopolímero. Com os resultados obtidos neste trabalho, pode-se dizer que a vinhaça é um substrato com potencial para ser utilizado por R. eutropha, com velocidades específicas máximas de crescimento superiores às encontradas em outros substratos, porém há a necessidade de uma fonte de carbono adicional para aumentar os percentuais de acúmulo de biopolímero. Uma dessas alternativas é o glicerol que quando adicionado à vinhaça a produção de P(3HB) aumentou. O glicerol foi mais rapidamente consumido e com rendimentos maiores por R. eutropha_glpFK que por R. eutropha DSM 545. Assim, pode-se dizer que, R. eutropha é capaz de crescer e produzir P(3HB) a partir de vinhaça e glicerol.<br>

Abstract : Polyhydroxyalkanoates (PHA), a biodegradable energy store of microbes, is an alternative to petroleum-derived thermoplastics. Researches had been foccused to develop efficient production process with low costs.The bacteria Ralstonia eutropha is one of the most studied microrganisms for P(3HB) production, a widely studied PHA. Vinasse is the main liquid waste from ethanol industry and its valorization by a process that use this waste as substrate for an added value product, like P(3HB), contributes to ethanol production, besides try to solve an environment problem related to this waste. Glycerol is one of the main carbon source present in vinasse. In this study, vinasse was used as substrate for P(3HB) production by R. eutropha DSM 545. Different vinasse concentrations were evaluated, and no inhibitory effect were observed. Batch cultivation was performed in bioreactor using vinasse (undiluted) plus the mineral medium salts and R. eutropha could growth until 5 g/L final cell concentration. Once the bacteria reached the stacionary growth fase while residual substrates were available, like glycerol, this study examined the enhancement of glycerol assimitation ability of R. eutropha DSM 545 by introduction of the genes of aquaglyceroporin (glpF), able to facilitate the glycerol transport, and glycerol kinase (glpK), able to phosphorylated glycerol to yield glycerol 3-phosphate, from Escherichia coli. The growth behavior of the recombinant strain was compared to the parental strain on glucose and results showed that the glpFK expression didn?t affect R. eutropha DSM 545 behavior. Batch cultivations in bioreactor were performed to compare the parental and the engineered strains, on vinasse, vinasse plus glycerol and glycerol, as culture medium. On cultivations using vinasse, the recombinat strain grow with a µmáx of 0,41 h-1, while R. eutropha was 0,18 h-1 and no P(3HB) production was observed, since the nitrogen limitation did not occurred. When vinasse plus glycerol was used as culture medium, aimed to increase the carbon source, R. eutropha_glpFK was able to growth with µmáx 0,33 h-1 and produced 34% of P(3HB), while the wild type grow with µmáx 0,19 h-1 and produced 15% of P(3HB). In the cultivations using only glycerol as substrate, without considering the difference in pre culture time, both strains showed the same behavior and produced about 35% of P(3HB). In conclusion, vinasse is a potencial substrate for R. eutropha, showing maximum specific growth rates higher when compared to others substrates, but it requires an extra carbon source to increase the P(3HB) accumulation. In this context, glycerol is a good alternative, since when it was used with vinasse the biopolymeraccumulation was higher and it was efficiently consumed by the engineered strain expressing glpFK genes.