Imobilização de lipases em suportes poliméricos

Abstract

O presente trabalho apresenta como objetivo principal a síntese de partículas poliméricas via miniemulsão para a imobilização das lipases de Candida antarctica B (CalB) e Thermomyces lanuginosus (TLL) e aplicação dos derivados enzimáticos na produção de ésteres etílicos de ácidos graxos. Na primeira etapa do trabalho, CalB foi imobilizada em nanopartículas de poliuretano via miniemulsão utilizando diisocianato de isoforona (IPDI) e poli(e-caprolactona) (PCL530) e crodamol. A fase aquosa foi composta por água deionizada, SDS, PEG400 e enzima. Diferentes intensidades da sonda de ultrassom foram testadas (70 e 90%) por 1, 2 ou 3 min. A atividade enzimática foi determinada por esterificação do ácido láurico e n-propanol, e o maior valor alcançado foi de 21 U/mg (70% por 2 min), com Dp=158 nm. CalB também foi imobilizada em nanopartículas de polimetilmetacrilato (PMMA) via miniemulsão. AIBN e KPS foram testados como iniciadores. A atividade enzimática foi avaliada por hidrólise do pNPP. CalB imobilizada em PMMA manteve a atividade por 20 ciclos de hidrólise, com atividade relativa acima de 40%. Na segunda etapa do trabalho, o suporte de poliuretano (PU) foi sintetizado como citado anteriormente, com exceção do crodamol, e antes de utilizado, as partículas foram liofilizadas. TLL foi imobilizada em PU sintetizado com diferentes tamanhos de cadeia de PEG. A atividade enzimática foi determinada por hidrólise do pNPB. TLL-PU-PEG6000 apresentou os melhores resultados de Km (0,183 mM) e Vmax (45,79 µmol/min/mg). O derivado se destacou também da produção de ésteres etílicos (EE) de ácidos graxos (260 mM.U-1). Os derivados foram recobertos com polietilenoimina (PEI) a 10 e 20% e trealose (10%). Os derivados recobertos com PEI 20% apresentaram os melhores resultados em termos de estabilidade à temperatura. O uso de agentes de ligação possibilitou um aumento de no mínimo 4 vezes na produção de EE de ácidos graxos. CalB também foi imobilizada em PU PEGuilado com diferentes cadeias de PEG. CalB-PU-PEG6000 apresentou os melhores valores de Km (0,815 mM) e Vmax (41,15 µmol/min/mg). O recobrimento com trealose possibilitou maior estabilidade térmica. CalB-PU-PEG400 apresentou os melhores valores de produção de EE, 43,72 e 16,83 mM.U-1 EE-EPA e DHA, respectivamente. C imobilizada em PU-PEG400, 4000 e 6000 também foi aplicada na hidrólise do etil éster de (R,S)ácido mandélico, apresentando razões enantioméricas satisfatórias (E>20). Foi possível imobilizar as lipases CalB e TLL nas partículas poliméricas via miniemulsão com elevadas porcentagens de imobilização e atividade recuperada. Elevadas concentrações de EE de EPA e DHA foram obtidas com os derivados propostos. <br>

Abstract: This current work shows as the main objective, the synthesis of polymeric particles via miniemulsion for the immobilization of Candida antarctica lipase B (CalB) and Thermomyces lanuginosus lipase (TLL) and application of the enzymatic derivatives for production of ethyl esters of fatty acids. In the first phase of the work, CalB was immobilized on polyurethane nanoparticles via miniemulsion using isophorone diisocyanate (IPDI) and poly(e-caprolactone) (PCL530) and crodamol. The aqueous phase was comprised of deionized water, SDS, PEG400 and enzyme. Differents ultrasound power intensities were tested (70 and 90%) by 1, 2 or 3 min. The enzyme activity was determined by esterification of lauric acid and n-propanol, and the highest value achieved was 21 U/mg (70% for 2 min), with Dp=158 nm. CalB was also immobilized on polymethylmethacrylate (PMMA) nanoparticles via miniemulsion. AIBN and KPS were tested as initiators. The enzymatic activity was evaluated by hydrolysis of pNPP. CalB immobilized on PMMA retained its activity over 20 cycles of hydrolysis, with relative activity above 40%. In the second phase of the work, the polyurethane support (PU) was synthesized as previously mentioned, with the exception of crodamol, and before using it, the particles were lyophilized. TLL was immobilized on synthesized PU with different sizes of PEG chain. The enzymatic activity was determined by hydrolysis of pNPB. TLL-PU-PEG6000 showed the best results of Km (0.183 mM) and Vmax (45.79 mmol/min/mg). The derivatives also highlighted the production of ethyl esters (EE) of fatty acids (260 mM.U-1). The derivatives were coated with polyethyleneimine (PEI) at 10 and 20%, and trehalose (10%). The derivatives coated with PEI 20% showed the best results in terms of temperature stability. The use of linking agents has enabled an increase of at least 4 times the production of EE of fatty acids. CalB was also immobilized on PU PEGylated with different PEG chains. CalB-PU-PEG6000 showed the best values of Km (0.815 mM) and Vmax (41.15 mmol/min/mg). The coating with trehalose allowed greater thermal stability. CalB-PU-PEG400 showed the best values of EE production, 43.72 and 16.83 mM.U-1 of EE-EPA and DHA, respectively. Calb immobilized on PU-PEG400, 4000 and 6000 was also applied for the hydrolysis of the (R,S) mandelic acid ethyl ester, presenting satisfactory enantiomeric ratios (E> 20). It was possible to immobilize the CalB and TLL lipases in polymeric particles via miniemulsion with high percentages of immobilization and recovered activity. High concentrations of EE of EPA and DHA were obtained with by proposed enzymatic derivatives.