Protocolo experimental para o estudo da cinética de desoxigenação da oxi-hemoglobina pelo método de fluxo interrompido

Abstract

A hemoglobina tem grande importância no processo de respiração celular e por esse motivo foi a proteína mais estudada durante o último século. Foi também a primeira molécula a ter sua estrutura desvendada utilizando-se de Raio-X. A cinética da reação de hemoglobina com oxigênio acontece de forma muito rápida, em milissegundos e deu início aos primeiros experimentos usando a técnica de mistura rápida. O fluxo interrompido consiste na mistura e injeção rápida de reagentes no interior de uma câmera de mistura, onde ocorre o início da reação após fechamento de uma eletroválvula que interrompe o fluxo. A partir desse momento são realizadas as leituras de absorbância ou fluorescência em função do tempo. Muitos trabalhos já foram realizados usando hemoglobina e um agente redutor, o ditionito de sódio. Porém a proposta do presente trabalho é avaliar o uso da meta-hemoglobina, a correta calibração do equipamento e a elaboração de um protocolo experimental no equipamento Stopped Flow Mixer (SFM-4000) que garanta uma mistura de forma homogênea sem cavitações resultando na desoxigenação da hemoglobina possibilitando a realização de análises futuras e cálculos de todas as etapas da reação. Os resultados obtidos nos experimentos em relação à constante de dissociação (koff) se mostraram de acordo com a literatura obtendo um valor de 40,24 s-1. O trabalho também comprovou que a meta-hemoglobina pode ser reduzida e utilizada para o estudo cinético com o oxigênio. No entanto, aproximar a reação de liberação de oxigênio como sendo de uma única etapa através de um cálculo de uma única constante de dissociação (koff) proposto por um modelo de pseudo-primeira ordem, mostrou-se válido até certo período de tempo, mas quando o tempo foi diminuído para 0,1 segundo foi possível observar que o mesmo não se ajusta aos instantes iniciais da reação.<br>

Abstract : Hemoglobin has a great importance in the process of respiration of living beings and for this reason has been the most studied protein over the last century. It was the first molecule to have its structure unraveled by X-ray. The kinetic reaction of hemoglobin with oxygen occurs very quickly, in milliseconds, and for this reason in the first experiments the rapid mixing technique was used. In this technique, the reagents are injected into a mixing chamber where the reaction occurs early after closure of a stopping valve that interrupts the flow. From that moment the absorbance readings versus time is registered. Many studies have used hemoglobin in combination with the reducing agent sodium dithionite. Nevertheless, the purpose of this study is to evaluate the use of the methemoglobin, the correct calibration of the equipment and the development of an experimental protocol in Stopped Flow Mixer equipment (SFM-4000) to ensure a mix homogeneously without cavitation resulting in deoxygenation hemoglobin enabling the realization of further analysis and calculations of all stages of the reaction. The result obtained in the experiments in relation to the dissociation constant is in accordance with the literature obtaining a koff of 40.24 s-1. The work also proved that methemoglobin can be reduced and used to study the kinetics with oxygen. However, the approximation of reaction described by a single step for calculating the dissociation constant (koff) proposed by a pseudo-first order kinetic model, proved to be valid until a certain period of time, but when the time was reduced to 0.1 second, it was possible to observe that it does not fit the initial stages of the reaction.