Imobilização e caracterização da lipase NS-40116 em poliestireno

Abstract

Lipases de Thermomyces lanuginosus apresentam um papel importante na indústria química e de alimentos. A lipase NS-40116 é uma nova lipase produzida a partir de Thermomyces lanuginosus, e será lançada no mercado com baixo custo em relação às lipases já comercializadas. A imobilização desta enzima em um suporte inerte, de baixo custo, que aumente sua estabilidade em diferentes condições de processo, e que permita sua reutilização, aparece como uma alternativa aos métodos de imobilização já existentes. Com o objetivo de conhecer o melhor método de interação entre partículas de poliestireno e a lipase NS-40116, diferentes métodos de imobilização foram estudados: adsorção ao suporte, retenção física em matriz, e ligação covalente pelo tratamento das partículas com glutaraldeído. Foram empregados dois métodos de polimerização para a produção do suporte. Na polimerização por suspensão em pérola foram utilizados estireno, polivinilpirrolidona e Trigonox® 141 como iniciador. O outro método foi a polimerização em emulsão através de estireno, álcool polivinílico, divinil benzeno, Span 80 e Trigonox® 141 como iniciador. O derivado com melhor atividade (7,96 U/g) foi obtido pela imobilização por adsorção ao suporte (partículas obtidas da polimerização em emulsão). A retenção física em matriz através da polimerização em suspensão resultou num derivado com atividade de 2,87 U/g, sendo que esta enzima foi escolhida para as posteriores caracterizações e aplicações, devido ao seu tamanho, que facilitou sua recuperação na síntese de ésteres metílicos a partir de gordura abdominal de frango. A caracterização das superfícies do suporte e da enzima imobilizada foi realizada por microscopia eletrônica de varredura. Espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (EITF) também foi realizada para caracterizar a enzima livre, o suporte e enzima imobilizada. A atividade enzimática foi medida por hidrólise utilizando p-NPP (p-nitrofenil palmitato) como substrato. A enzima livre e o derivado enzimático imobilizado foram avaliados por 2 h em diferentes pHs (2,1, 3, 3,43, 4,75, 7, 8, 9, 10, 11 e 12), temperaturas (30, 40, 50, 60, 65 e 75 ºC), e solventes (metanol, etanol, hexano e propanol). Os parâmetros cinéticos das duas enzimas (Km e Vmax) foram obtidos através do sistema gráfico de Lineweaver & Burk. Para a estabilidade ao armazenamento, as enzimas foram monitoradas por 106 dias em temperatura ambiente, e 122 dias sob refrigeração (6 ºC). O derivado imobilizado foi eficazmente utilizado na produção de ácidos graxos livres a partir do óleo de soja, bem como apresentou potencial de aplicação em reações de transesterificação e esterificação utilizando gordura abdominal de frango como substrato. Na hidrólise do óleo de soja, o derivado demonstrou estabilidade operacional após cinco ciclos de uso.<br>

Abstract : Lipases B from Thermomyces lanuginosus has an important role in chemical and food industry. The lipase NS-40116 is a novel lipase produced from Thermomyces lanuginosus, and it will be launch in the market with low cost in relation to lipases already commercialized. The immobilization of the enzyme on an inert support, low cost, to increase its stability under different process conditions, and allows their reuse is an alternative to existing methods of immobilization. With the aim of knowing the best method to interact polystyrene particles and lipase NS-40116, different methods of immobilization were studied: support adsorption, entrapment and covalent bond by treating the particles with glutaraldehyde. Two polymerization methods were used for the production of the support. In the pearl suspension polymerization were used styrene, polyvinylpyrrolidone and Trigonox® 141 was used as the initiator. The other method was emulsion polymerization through styrene, polyvinyl alcohol, divinyl benzene, Span 80 and Trigonox® 141 as the initiator. The highest enzyme activity (7.96 U/g) was obtained in support adsorption method. The entrapment through suspension polymerization resulted in a derivative with activity of 2.87 U/g, and this enzyme was chosen for the later characterizations and applications, due to its size, than facilitated its recovery in the synthesis of methyl esters from chicken abdominal fat. The characterization of the surfaces of the support and immobilized enzyme was performed by scanning electron microscopy. Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) was also performed to characterize the free enzyme, the support and immobilized enzyme. The enzymatic activity was measured by hydrolysis of p-NPP (4-nitrophenyl palmitate) as substrate. The free enzyme and immobilized enzyme derivative were evaluated during 2 h at different pHs (2.1, 3, 3.43, 4.75, 7, 8, 9, 10, 11 and 12), temperatures (30, 40, 50, 60, 65 and 75 ºC), and solvents (methanol, ethanol, hexane and propanol). The kinetic parameters of the two enzymes (Km and Vmax) were obtained through the Lineweaver & Burk graph system. For storage stability, the enzymes were monitored for 106 days at room temperature, and 122 days under refrigeration (6 °C). The immobilized derivative was effectively used in the production of free fatty acids from soybean oil, and also showed application potential in transesterification and esterification reactions using chicken abdominal fat as substrate. In the hydrolysis of soybean oil, the derivative demonstrated operational stability after five cycles of use.