Identificação do complexo exossoma de RNA de Trypanosoma rangeli e caracterização da subunidade associada EAP3

Abstract

Exossoma de RNA é um complexo multiproteico composto por 12 subunidades, que possui atividade catalítica no sentido 3 ? 5 e está envolvido no processamento e degradação de vários tipos de RNAs. As subunidades RRP6 (Ribossomal RNA Processing 6) e RRP44 (Ribossomal RNA Processing 44) são responsáveis pela atividade catalítica e as demais subunidades envolvidas no direcionamento e seleção de transcritos para processamento ou degradação. O Trypanosoma rangeli, juntamente com outros tripanosomatídeos, apresentam deficiência no sistema de regulação de fatores de transcrição, portanto o mecanismo de regulação da expressão gênica nestes organismos ocorre predominantemente a níveis pós-transcricionais através da regulação dos níveis de RNA, sendo esses níveis regulados a partir da degradação dos transcritos. No presente estudo realizamos a caracterização de três subunidades do complexo exossoma de T. rangeli. A subunidade RRP6 de T. rangeli possui uma janela aberta de leitura de 2.133 pares de base que codifica para um polipeptídio de 710 aminoácidos (± 78,7 kDa). Foram identificados os domínios conservados PMC2NT, DEDD-Y e HRDC, que também se encontram presentes em outros organismos em que o complexo exossoma de RNA está caracterizado. Foi realizado teste de expressão heteróloga desta proteína em E. coli BL21 CodonPlus, porém sem sucesso de isolamento. A subunidade RRP44 de T. rangeli possui uma janela aberta de leitura de 3012 pares de base que codifica para um polipeptídio de 1003 aminoácidos (± 113,2 kDa). Os domínios conservados presentes nesta proteína são PIN, Exoribonuclease R e RNB. Foi realizada a expressão heteróloga desta proteína em E. coli BL21 CodonPlus, porém não tivemos sucesso do rendimento da proteína para o posterior etapa de purificação. A subunidade EAP3 (Exosome Associated Protein 3) possui uma janela aberta de leitura de 547 pares de base que codifica para um polipeptídio de 181 aminoácidos (± 20 kDa) e está descrita como uma proteína associada ao exossoma de RNA formando um heterodímero com a subunidade RRP6. Em ensaios de Western blot utilizando o antissoro produzido essa interação in vivo foi comprovada, uma vez que a ligação do anticorpo ocorreu na banda de ±150 kDa. As sequências do complexo exossoma de RNA apresentam porcentagens de identidade altas, demonstrando ser uma maquinaria conservada entre os tripanosomatídeos, porém com sua funcionalidade ainda desconhecida.<br>

Abstract : RNA exosome complex is a multiprotein complex composed of 12 subunits, which has 3 '? 5' catalytic activity and is involved in the processing and degradation of several types of RNAs. The subunits RRP6 (Ribosomal RNA Processing 6) and RRP44 (Ribosomal RNA Processing 44) are responsible for the catalytic activity, and the other subunits are involved in the targeting and selection of transcripts for processing or degradation. Trypanosoma rangeli, together with other trypanosomatids, are deficient in the regulation system of transcription factors, so the regulation mechanism of gene expression in these organisms occurs exclusively at post-transcriptional levels through of RNA levels regulation, these levels being regulated from the degradation of the transcripts. In the present study we performed the characterization of subunits of the T. rangeli exosome complex. The RRP6 subunit of T. rangeli has an open reading frame of 2,133 base pairs coding for a polypeptide of 710 amino acids (± 78.7 kDa). The conserved domains identified was PMC2NT, DEDD-Y and HRDC, which are also present in other organisms in which the RNA exosome complex is characterized, have been identified. A heterologous expression test of this protein was performed in E. coli BL21 CodonPlus, but with no success of isolation. The RRP44 subunit of T. rangeli has an open reading frame of 3012 base pairs encoding a polypeptide of 1003 amino acids (± 113.2 kDa). The conserved domains present in this protein are PIN, Exoribonuclease R and RNB. The heterologous expression of this protein was performed in E. coli BL21 Codon Plus, but we did not have a success of protein yield for the subsequent protein purification process. The EAP3 (Exosome Associated Protein 3) subunit has an open reading frame of 547 base pairs encoding a polypeptide of 181 amino acid (± 20 kDa) and is described as a protein associated with the RNA exosome forming a heterodimer with the subunit RRP6. In Western Blotting assays using the antiserum produced from purified protein this in vivo interaction was proven, since antibody binding occurred in the ~ 150 kDa band, which corresponds to the sum of the proteins. The sequences of the RNA exosome complex have high identity percentages, demonstrating that it is a conserved machinery among the trypanosomatids, but with its still unknown functionality.