Microalgae biomass as a source of natural compounds: chemical characterization and new approaches for lipid extraction and culture harvesting

Abstract

Abstract: Microalgae have emerged as a source of a wide range of compounds, which enable the development of a variety of products for pharmaceutical, nutraceutical and cosmetic industries. The extraction of these natural compounds is essential for the commercialization of these high value compounds (HVPs) from microalgae. The success of the extraction depends on the affinity of the compounds with the solvent used in the process that should be suitable for the extraction of value compounds. In this context, this thesis is addressed to the extraction of compounds from the biomass from three marine microalgae species (Phaeodactylum tricornutum, Nannochloropsis oculata and Porphyridium cruentum), using subcritical n-butane for the obtainment of the crude extracts. In order to compare and evaluate the affinity of n- butane with the extracted compounds, were also applied to each microalgae biomass, organic solvent extraction through Soxhlet method (AOAC 963.15) and supercritical extraction using CO2 (SC-CO2) as solvent. For the obtainment of the biomass needed for the extraction experiments, the microalgae cultivation and the steps of harvesting, washing and drying of biomass were performed. With the obtainment of the dry biomass, the chemical composition was determined (moisture, ashes, proteins, carbohydrates, lipids and fatty acids profile) for each species. The proposed extraction methods were applied to the three different microalgae biomass, and the fatty acids composition of the extracts obtained by each method were compared. The same extracts obtained by SC-CO2 and subcritical n-butane were evaluated regarding to their antioxidant activities using DPPH radical scavenging assay. The total carotenoids content was also quantified by UV-visible (UV-vis) and the results correlated. Furthermore, a case study was developed for the harvesting step at pilot scale, using the protozoan Tetrahymena as flocculant agent in microalgal cultures of Chlorella sorokiniana 8-C4 (australian local strain). From the results obtained from the chemical composition of each microalgae cultivated for the extraction experiments, these species were suggested for the enhancement of food products considering their respective nutritional benefits. Comparing the extraction methods used, subcritical n-butane extracted higher percentages of polyunsaturated fatty acids (?3 and ?6) than supercritical CO2, and in some cases reached higher affinity with these compounds than the organic solvent, showing it to be a suitable method for the extraction of high value fatty acids (i.e. eicosapentaenoic acid, docosahexaenoic acid, arachidonic acid). The extracts obtained by CO2 and n-butane as solvents presented antioxidant activity values against the radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), where the subcritical n-butane extract of P. cruentum presented the highest capacity to scavenge DPPH, showing value close to the synthetic antioxidant butylated hydroxytoluene (BHT). Moreover, the correlation between the antioxidant activity results and carotenoids content was considered significant (R2=0.8021) between the obtained extracts, independent of the method used. In the case study about the application of the protozoan Tetrahymena as bioflocculant in microalgal cultures of C. sorokiniana, was possible to obtain an OD750 concentration profile along the flocculator developed for the assays. From the verified OD750 profile a gradient of suspended solids (algal cells) was demonstrated along the cylinder, however the expected efficiency was not achieved, suggesting the performance of more experimentation towards the optimization of this biomass pre-concentration process, which is still in early stages of research.<br>

Resumo expandido: As microalgas têm emergido como fonte de vasta gama de compostos que possibilitam o desenvolvimento de grande variedade de produtos, desde biocombustíveis até produtos de alto valor agregado. A extração de compostos da biomassa é uma etapa essencial para a comercialização de produtos a partir das microalgas, e seu sucesso depende da afinidade dos compostos em questão com o solvente utilizado no processo. Neste contexto, a presente tese trata da extração de compostos da biomassa de três espécies de microalgas marinhas (Phaeodactylum tricornutum, Nannochloropsis oculata e Porphyridium cruentum) utilizando n-butano subcrítico como solvente na obtenção dos extratos brutos. Com o intuito de comparar e avaliar a afinidade do n-butano com os compostos extraídos, também foram aplicados à biomassa de cada espécie, extração com solvente orgânico através do método de Soxhlet (AOAC 963.15) e extração supercrítica utilizando CO2 (SC-CO2). Para a obtenção da biomassa necessária para os experimentos de extração, foram desenvolvidos os cultivos das microalgas e as etapas de separação, lavagem e secagem da biomassa. Com a obtenção da biomassa seca, foi determinada a composição química (umidade, cinzas, proteínas, carboidratos, lipídios e perfil de ácidos graxos) de cada espécie. Foram aplicados os três diferentes métodos de extração propostos, onde foi comparada a composição de ácidos graxos dos extratos obtidos por cada método de extração das três espécies produzidas. Os mesmos extratos obtidos via SC-CO2 e n-butano subcrítico foram avaliados quanto as suas atividades antioxidantes utilizando o radical 2,2-difenil-1- picrilhidrazil (DPPH) como método de determinação. Os resultados de atividade antioxidante foram correlacionados com os valores conteúdos de carotenóides totais, quantificados por UV-visível (UV-vis). Além disso, foi desenvolvido um estudo de caso em escala piloto para a etapa de separação da biomassa, onde foi utilizado o protozoário Tetrahymena como agente floculador em culturas da microalga Chlorella sorokiniana 8-C4 (espécie local australiana). A partir dos resultados sobre a composição química da biomassa de cada microalga produzida para os experimentos de extração, espécies foram sugeridas para o enriquecimento de alimentos considerando seus respectivos benefícios nutricionais. Comparando-se os métodos de extração utilizados, n- butano subcrítico extraiu as maiores porcentagens de ácidos graxos poli- insaturados (?3 e ?6) do que CO2 supercrítico e em alguns casos obteve maior afinidade com estes compostos do que o solvente orgânico, mostrando-se um método adequado para a extração de ácidos graxos de alto valor agregado (ácido eicosapentaenóico, ácido docosahexaenóico, ácido araquidônico, por exemplo). Os extratos obtidos através de SC- CO2 e n-butano apresentaram diferentes níveis de atividade antioxidante frente ao radical DPPH, onde o extrato obtido da microalga P. cruentum utilizando n-butano como solvente apresentou a maior capacidade de sequestro do radical DPPH, apresentando valor mais próximo ao antioxidante sintético hidroxitolueno butilato (BHT). Ainda, a correlação entre os resultados de atividade antioxidante e conteúdo de carotenóides foi considerada significante (R2 = 0.8021) entre os extratos obtidos, independentemente do método utilizado. No estudo de caso da aplicação do protozoário Tetrahymena como biofloculante em culturas da microalga C. sorokiniana, foi possível a obtenção de um perfil de concentração de OD750, ao longo do floculador desenvolvido para os testes. A partir do perfil de OD750 constatado foi demostrado um gradiente de sólidos suspensos (células algais) ao longo do cilindro, no entanto a eficiência esperada no processo não foi atingida, o que sugere a realização de mais experimentações na busca da otimização deste processo de pré-concentração da biomassa, que ainda se encontra em estágio inicial de pesquisa.