Mecanismos neuroquímicos associados aos efeitos tipo-antidepressivo e neuroprotetor de inosina

Abstract

Inosina é um nucleosídeo purinérgico endógeno, formada a partir da adenosina, em uma reação catalisada pela enzima adenosina deaminase. Já foram descritos efeitos antinociceptivos, anti-inflamatórios, neuroprotetores e antidepressivos para inosina, que podem estar associados à ativação de receptores de adenosina. Contudo, existem poucas evidências na literatura relacionando às vias de sinalização intracelular envolvidas nesses efeitos, bem como de outros mecanismos neuroquímicos associados aos efeitos dessa purina. Baseado nisso, o presente trabalho investigou alguns dos mecanismos associados aos efeitos tipo-antidepressivo de inosina em camundongos e no efeito neuroprotetor da inosina in vitro. Primariamente, um dos objetivos desse trabalho foi investigar a modulação de vias de sinalização intracelular e de receptores glutamatérgicos no efeito tipo-antidepressivo de inosina, através do teste da suspensão pela cauda (TSC), e na atividade locomotora, através do teste do campo aberto (TCA). Adicionalmente, foi verificado o efeito da administração de inosina sobre o imunoconteúdo e fosforilação (ser-133) do fator de transcrição CREB, imunoconteúdo das proteínas sinápticas PSD95 e sinapsina I, bem como da subunidade GluA1 do receptor glutamatérgico AMPA e A1 e A2A dos receptores de adenosina. Nenhum dos tratamentos alterou a locomoção dos animais no TCA. Inosina administrada pela via intraperitoneal (i.p.) induziu um efeito antiimobilidade no TSC nas doses de 1 mg/kg e 10 mg/kg. O efeito tipoantidepressivo de inosina foi abolido pelo pré-tratamento dos animais com U0126 [inibidor de MEK, 5µg/sítio administrado pela via intracerebroventricular (i.c.v.)], KN-62 (inibidor de CaMKII, 1µg/sítio, i.c.v.), H-89 (inibidor de PKA, 1µg/sítio, i.c.v.), wortmanina (inibidor de PI3K, 0,1µg/sítio, i.c.v.), rapamicina (inibidor de mTORC1, 0,2nmol/sítio, i.c.v.), NMDA [agonista dos receptores glutamatérgicos do tipo NMDA (NMDAR) 0,1pmol/sítio, i.c.v.] e D-serina (coagonista de NMDAR, 30µg/sítio, i.c.v.). Também foi observado um efeito tipoantidepressivo sinérgico entre doses sub-efetivas de inosina (0,1 mg/kg, i.p.) e AR-A014418 (inibidor de GSK-3b, 0,001µg/sítio, i.c.v.), cetamina (antagonista NMDAR, 0,1 mg/kg, i.p.) ou MK-801 (antagonista NMDAR, 0,001 mg/kg, administrado por gavagem). Contudo, o pré-tratamento com DNQX (antagonista dos receptores AMPA, 2,5 µg/sítio, i.c.v.), não alterou o efeito anti-imobilidade de inosina (10 mg/kg, i.p.). No período de 24 h após a administração de inosina (10 mg/kg, i.p.) foi verificado um aumento de fosforilação de CREB no hipocampo dos animais, sem alterações no imunoconteúdo de CREB nessa estrutura, ou na fosforilação e imunoconteúdo no cortéx pré-frontal (CPF). Também não foram verificadas alterações na fosforilação e imunoconteúdo de CREB no CPF e hipocampo 30 minutos após a administração de inosina. Adicionalmente, não foram encontradas alterações no imunoconteúdo de PSD95, GluA1, sinapsina I e dos receptores A1 e A2A de adenosina no hipocampo e CPF 30 min e 24 horas após a administração de inosina. Esses resultados demonstram o envolvimento da inibição de NMDAR e GSK-3b e da ativação de MEK/ERK 1/2, CaMKII, PKA, PI3K/AKT e mTORC1 no efeito tipo-antidepressivo de inosina. Notavelmente, uma única dose de inosina foi capaz de induzir um aumento na fosforilação de CREB no hipocampo. Outro objetivo desse trabalho envolveu o estudo do potencial neuroprotetor da inosina contra a morte celular induzida por metilmercúrio (MeHg) em cultura primária de astrócitos corticais provenientes de ratos neonatos. O co-tratamento com inosina (50-1000µM) e MeHg (5 µM) por 6 h preveniu a redução na viabilidade celular induzido por esse toxicante, avaliada pelo método de redução do MTT. Não foram verificados efeitos protetores após o co-tratamento por 24 h, mas foi observado um efeito protetor após o pré-tratamento com inosina (50-1000µM) por 24 h seguido do co-tratamento com inosina nas mesmas concentrações e MeHg (5 µM) por 24 h adicionais. O tratamento das culturas celulares com inosina (500 µM) por 6 h, também preveniu o aumento na geração de espécies reativas de oxigênio induzidos por MeHg (5 µM) avaliado pela sonda H2DCFDA. Contudo, não foram verificadas alterações nos níveis de glutationa total e reduzida induzidos pelos tratamentos com inosina e/ou MeHg. O tratamento com inosina estimulou a expressão do RNAm para NQO-1, Nrf2 e BDNF além de aumentar o imunoconteúdo de Nrf2 no núcleo celular. Também foi verificado um aumento transitório na fosforilação de AKT (ser-473) por inosina (500 µM), e o prétratamento com wortmanina (1 µM) preveniu o efeito neuroprotetor de inosina (500 µM) frente à neurotoxicidade do MeHg (5 µM). Não foram verificadas alterações na fosforilação de ERK1/2 após o tratamento com inosina e o prétratamento com U0126 (10 µM) não preveniu o efeito neuroprotetor dessa purina. Adicionalmente, o efeito neuroprotetor de inosina (500 µM) foi prevenido pelo pré-tratamento com MRS1523 (antagonista dos receptores A3 de adenosina, 1µM), mas não foram verificadas alterações pelo pré-tratamento com PSB36, (antagonista dos receptores A1 de adenosina, 10 nM) ou pelo pré-tratamento com SCH58261, (antagonista dos receptores A2A de adenosina, 100 nM). Assim, esses resultados indicam que inosina pode exercer um efeito protetor contra a toxicidade induzida por MeHg em astrócitos, possivelmente ativando o receptor A3 de adenosina e a sinalização de PI3K/AKT, além da ativação do fator de transcrição Nrf2. Em conjunto, os resultados desse trabalho demonstram novos mecanismos moleculares referentes aos efeitos antidepressivos e neuroprotetores de inosina, ressaltando a participação do sistema purinérgico em diferentes processos no sistema nervoso central.<br>

Abstract : Inosine is an endogenous purinergic nucleoside formed by the adenosine breakdown in a reaction catalyzed by the enzyme adenosine deaminase. It has been reported antinociceptive, anti-inflammatory, neuroprotective, and antidepressant effects for inosine that may occur through adenosine receptors activation. However, there is little evidence regarding the signaling pathways and others neurochemical mechanisms associated to the effects elicited by this purine. The present study investigated the neurochemical mechanisms associated to inosine antidepressant-like and neuroprotective effects. First, it was investigated, in adult mice, the participation of intracellular signaling pathways and glutamatergic receptors on the inosine antidepressant-like effect, evaluated by tail suspension test (TST) and the locomotor activity was evaluated by the open field test (OPT). Moreover, the effect of inosine administration in the phosphorylation levels and imunocontent of the transcription factor CREB and the imunocontent of synaptic proteins PSD95 and synapsin-I, as well as GluA1 subunit of AMPA receptor and A1 and A2A adenosine receptors was also evaluated. None of the treatments changed the locomotor activity in the OPT. Inosine administered by the intraperitoneal route (i.p.) in the doses of 1 and 10 mg/kg induced an antidepressant-like effect in the TST. The anti-immobility effect of inosine was prevented by pre-treatment of mice with U0126 [MEK inhibitor, 5µg/site administered by intracerebroventricular route (i.c.v.)], KN-62 (CaMKII inhibitor, 1µg/site, i.c.v.), H-89 (PKA inhibitor, 1µg/site, i.c.v.), wortmanin (PI3K inhibitor, 0.1µg/site, i.c.v.), rapamycin (mTORC1 inhibitor, 0.2 nmol/site, i.c.v.), NMDA [agonist of NMDA glutamatergic receptors (NMDAR) 0.1 pmol/site, i.c.v.] and D-serine (NMDAR co-agonist, 30µg/site, i.c.v.). It was also observed a synergic antidepressant-like effect elicited by subeffective doses of inosine (0.1mg/kg, i.p.) and AR-A014418 (GSK-3b inhibitor, 0.001µg/site, i.c.v.), ketamine (NMDAR antagonist, 0.1 mg/kg, i.p.), MK-801 (NMDAR antagonist, 0.001 mg/kg, administered by gavage). However, the pretreatment with DNQX (AMPA receptors antagonist, 2.5 µg/site, i.c.v.), did not changed inosine antidepressant-like effect (10 mg/kg, i.p.). 24 h after inosine administration (10 mg/kg, i.p.) an increase in CREB phosphorylation without alterations in CREB imunocontent was found in mice hippocampus. No alterations in CREB imunnocontent and phosphorylation were found 30 minutes after the administration of inosine. Furthermore, the imunocontent of synaptic proteins (PSD95, GluA1 and synapsin-I), as well as A1 and A2A adenosine receptors, was not altered 30 min and 24 h after inosine administration. These results suggest the participation of NMDAR and GSK-3b inhibition, and MEK/ERK 1/2, CaMKII, PKA, PI3K/AKT and mTORC1 activation in the antidepressant-like effect of inosine in the TST. Moreover, a single administration of inosine was able to induce an increase in CREB phosphorylation in the hippocampus. Another aim of the study was to determine the neuroprotective effect of inosine against methylmercury (MeHg) toxicity in cortical astrocyte primary culture from newborn rats. The co-treatment with inosine (50-1000µM) and MeHg (5 µM) for 6 h prevented the decrease in cell viability induced by MeHg. No protection was observed after the co-treatment with inosine (50-1000µM) and MeHg (5 µM) for 24 h, but a neuroprotective effect, assessed by MTT reduction method, was observed after inosine pretreatment (50-1000µM) for 24 h followed by co-treatment with inosine (in the same concentrations) and MeHg (5 µM) for additional 24 h. Inosine (500 µM) prevented the increase in the oxygen reactive species generation (evaluated by H2DCFDA probe) induced by MeHg (5 µM) for 6 hours, but no changes in the reduced and total glutathione levels were observed. Inosine treatment (500 µM) also induced an increase in NQO-1, Nrf2, BDNF mRNA expression and Nrf2 immunocontent in cell nucleus. It was also observed a transient increase in AKT (ser-473) phosphorylation induced by this purine, and wortmanin pre-treatment (1 µM) prevented the inosine neuroprotective effect. No alterations were observed in ERK 1/2 phosphorylation after the treatment with inosine and the neuroprotective effect of this purine was not prevented by the pre-treatment with U0126 (10 µM). Additionally, the neuroprotection elicited by inosine was prevented by MRS1523 (A3 adenosine receptor antagonist, 1µM), but no changes were observed after the pre-treatment with PSB36 (A1 adenosine receptor antagonist, 10 nM) nor SCH58261 (A2A adenosine receptor antagonist). These results indicated that inosine induced a neuroprotective effect against MeHg in astrocytes that may occur by A3 adenosine receptor and PI3K/AKT activation, and this purine can also activate Nrf2. Taken together, our results showed new mechanisms for inosine antidepressant and neuroprotective effects, reinforcing the participation of the purinergic system in various processes in the central nervous system.