Efeito do tratamento com fluidos pressurizados na conformação estrutural e atividade enzimática da lisozima

Abstract

A possibilidade de incremento na atividade enzimática oriunda da interação entre as enzimas e os fluidos pressurizados vem impulsionando inúmeras pesquisas na área da enzimologia. A tecnologia de alta pressão é uma técnica promissora como pré-tratamento de enzimas e o estudo das alterações das estruturas dos biocatalisadores são importantes, uma vez que há poucos trabalhos publicados na literatura e existe a necessidade de desvendar algumas indefinições sobre a estabilidade e a atividade enzimática em fluidos pressurizados. Neste contexto, o presente trabalho teve por objetivo investigar a influência da pressão, força iônica e taxa de despressurização na atividade e conformação estrutural da lisozima, utilizando CO2 supercrítico (scCO2), GLP e R134a como solventes. Para tanto, os experimentos foram realizados utilizando um reator de volume variável sob tempo de exposição de 2 h, temperatura de 40 ºC, variando a pressão (100 a 200 bar), taxa de despressurização (10 a 50 bar.min-1) e concentração de cloreto de sódio (0 a 50 mmol.L-1). Planejamentos experimentais 23 e 22 com três repetições no ponto central foram utilizados para identificar o efeito das variáveis do processo bem como das possíveis interações entre elas na perda/ganho da atividade da lisozima. Por fim, estudos de estabilidade da enzima em baixas temperaturas (4 ºC e -10 ºC) após tratamento com fluidos pressurizados também foram realizados. A maior atividade residual observada foi de 141,01 ± 1,80 % para a condição de 150 bar e taxa de despressurização de 30 bar.min-1, sem o CO2 em contato com a enzima. As análises de alterações conformacionais da enzima demonstraram que a estrutura primária permaneceu inalterada em todas as condições estudadas. Em temos de estrutura secundária e terciária as análises mostraram alterações conformacionais da lisozima para as condições testadas. Estes estudos permitiram uma melhor compreensão das alterações da estrutura da enzima em pressões elevadas, resultando em uma melhor utilização e otimização das condições experimentais em processos de biocatálise futuros.

Abstract: The possibility of increase in the enzymatic activity from the interaction between the enzymes and the pressurized fluids has stimulated numerous researches in enzymology. High-pressure technology is a promising technique as a pretreatment enzyme and the study of changes in the structure of the biocatalysts are important, since there are few papers published in the literature and there is a need to reveal some uncertainties about the stability and enzymatic activity in pressurized fluids. In this context, the objective of this work was to investigate the influence of pressure, ionic strength and depressurizing rate on the activity and structural conformation of the lysozyme using supercritical CO2 (scCO2), GLP and R134a as solvents. For this purpose, the experiments were carried out using a variable volume reactor under a 2 h exposure time, at a temperature of 40 °C, varying the pressure (100 to 200 bar), the depressurizing rate (10 to 50 bar.min-1) and concentration of sodium chloride (0 to 50 mmol.L-1). Experimental design 23 e 22 with three replications at the center point were used to identify the effect of process variables and the possible interactions among them in the loss/gain of the lysozyme activity. Finally, enzyme stability studies at low temperatures (4 °C and -10 °C) after treatment with pressurized fluids were also performed. The highest residual activity observed was 141.01 ± 1.80 % for the condition of 150 bar and depressurizing rate of 30 bar.min-1, with no CO2 in contact with the enzyme. The lowest residual activity was 88.3 % for the 200 bar condition and 10 bar.min-1 depressurizing rate, with CO2 in contact with the enzyme. Analyzes of conformational changes of the enzyme demonstrated that the primary structure remained unchanged in all conditions studied. The secondary and tertiary structure analyzes showed conformational changes of lysozyme for the conditions tested. These studies allowed a better understanding of the changes in the enzyme structure at high pressures, resulting in a better use and optimization of the experimental conditions in future biocatalysis processes.