Estratégias para ampliação do uso do autoamostrador combinadas a injeções múltiplas na determinação de metformina em amostras de plasma de tilápia-do-nilo por cromatografia líquida de interação hidrofílica acoplada a espectrometria de massas

Abstract

A presente pesquisa propôs-se a explorar funcionalidades do autoamostrador, integrando estratégias para preparação de curvas de calibração em sua seringa com um método combinado ao emprego da padronização interna por injeção do próprio analito, outer plug internal standard (OPIS), segregando-o da amostra por injeções múltiplas, multiple injection in a single experimental run (MISER). Com este último alcançou-se maior confiabilidade na análise quantitativa, ao ampliar a repetitividade entre dias em análises ESI-MS/MS no modo positivo, na determinação de metformina em 16 amostras de plasma de tilápias-do-nilo. Com o volume de injeção de 2,0 ?L foram preparadas soluções de diferentes níveis de concentração a partir de solvente puro, solução padrão de metformina e extrato das amostras, obtidos após precipitação protéica com acetonitrila (0,1% ácido fórmico, v/v) para que, por fim, fosse possível reproduzir a calibração por fortificação de extrato de matriz isenta. Este procedimento foi realizado sem a interferência do operador, com pouco volume de amostra, de maneira a minimizar o uso da matriz, com ciclos de injeção de aproximadamente 25 s cada. Para a separação optou-se pela modalidade de cromatografia líquida de interação hidrofílica (HILIC), a qual pode ser cumprida utilizando uma coluna cromatográfica (4,6 mm x 150 mm; 5 ?m; 40°C) de fase estacionária composta por ciclofrutano-6 nativo, quimicamente ligado à sílica (FRULIC-N). A eluição do analito foi conduzida a 0,5 mL min-1 com fase móvel gradiente composta por acetonitrila/água (70:30,, v/v), ambos contendo 10 mmol L-1 de formiato de amônio, e pH da solução aquosa mantido em 3,2. O método foi validado e, apresentou boa compatibilidade com o modelo linear (R2 = 0,999) na faixa de concentração avaliada (20 ? 140 ng mL-1). O limite de detecção foi de 0,8 ng mL-1 e o limite de quantificação 2,1 ng mL-1. As precisões instrumental, intra-ensaio e inter-ensaio, expressas pelo coeficiente de variação para a área do pico, apresentaram valores melhores que 3,28%. Do ensaio de recuperação foram obtidas concordâncias de 94,2% - 99,8%. E o método proposto propiciou o dispêndio de 3,7 vezes menos tempo e solventes quando comparado ao método de injeção convencional para um mesmo número de amostras.<br>

Abstract : The aim of the present study was to explore the functions of autosampler, integrating strategies for the preparation of calibration curves in the autosampler?s syringe with a method that uses the analyte itself as internal standard, called outer plug internal standard (OPIS), segregating it from the sample by multiple injections in a single experimental run (MISER). With this procedure greater reliability was achieved in a quantitative analysis, by increasing the repeatability between days in positive-mode ESI-MS/MS analyzes applied in the determination of metformin in 16 plasma samples from Nile tilapia. At the injection volume of 2.0 ?L, solutions of different concentration levels were prepared from mixing pure solvent, standard solution of metformin and extract of the samples, obtained after protein precipitation with acetonitrile (0.1% formic acid, v/v), than finally, it was possible to reproduce the calibration by addition in the free matrix extract. This procedure was performed without interference from the operator, with a small sample volume, in order to minimize the use of the matrix, with injection cycles of approximately 25 s each. For the separation, the hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) method was chosen, which can be accomplished using a stationary phase chromatographic column (4.6 mm x 150 mm, 5 ?m; 40 ° C) composed of native cyclofructan-6, chemically bounded to silica (FRULIC-N). Analyte elution was conducted at 0.5 mL min-1 with a gradient phase mobile composed of acetonitrile/water (70:30, v/v), both containing 10 mmol L-1 of ammonium formate, and pH of aqueous solution fixed at 3.2. The method was validated and presented good compatibility with the linear model (R2 = 0.999) in the evaluated concentration range (20 - 140 ng mL-1). The limit of detection and quantitation was 0.8 ng mL-1 and 2.1 ng mL-1, respectively. The instrumental, intra-assay and inter-assay precision, expressed by the relative standard deviation for the peak area, presented values better than 3.28%. From the recovery assay concordances of 94.2% - 99.8% were obtained. And the proposed method allowed the waste of 3.7 times less analysis time and solvents when compared to the conventional injection method for the same number of samples.