Matrizes nanoestruturadas bioativas para aplicação na regeneração de nervos periféricos

Abstract

A eletrofiação é uma promissora técnica à geração de sistemas de liberação de fármacos e engenharia de tecidos. Este trabalho descreve o desenvolvimento de matrizes nanoestruturadas permissivas à diferenciação de células neuronais. Inicialmente, o efeito dos parâmetros processuais da eletrofiação e da configuração do coletor na arquitetura das fibras foi estudado. O processo foi otimizado para obtenção de nanofibras randomizadas e alinhadas. Nanofibras de policaprolactona (PCL) foram produzidas usando três configurações de coletor: um cilindro metálico rotatório, fios de cobre e um mandril rotatório. O coletor cilíndrico gerou uma nanomatriz com estrutura típica tridimensional, na qual a velocidade de rotação mecanicamente promoveu a redução do diâmetro e alinhamento das fibras. Um padrão de fibras randomizadas com um diâmetro médio de 1142 ± 391 nm foi observado a 0 rpm, enquanto nanofibras alinhadas com um diâmetro médio de 663 ± 334 nm foram produzidas a 2000 rpm. Os cabos de cobre originaram um novo padrão de matriz, cujo grau de orientação das fibras relacionou-se à distribuição do campo elétrico no coletor. Por sua vez, o coletor de mandril deu origem a uma matriz tubular constituída de fibras com diâmetro médio de 606 ± 329 nm. Em seguida, avaliou-se a influência do efeito do polietilenoglicol (PEG) em nanofibras compostas por blendas de PEG e PCL. Três tipos de PEG consoante à massa molecular (400, 1500, e 35000 Da) e três concentrações (1, 5, e 10% em relação à PCL) foram estudados. As matrizes foram caracterizadas quanto a sua arquitetura por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e propriedades mecânicas por teste de tração uniaxial, utilizando um analisador de textura. Em presença de PEG houve uma redução do diâmetro e da resistência mecânica das fibras. Estudos de cultura celular demonstraram a ausência de citotoxicidade destes biomateriais. A adequação do uso do PEG para prolongar a liberação de NGF foi demonstrada. A bioatividade do NFG incorporado nas matrizes foi avaliada através da diferenciação de células PC12. As matrizes constituídas de nanofibras alinhadas promoveram o alinhamento de neuritos e a presença de PEG influenciou positivamente o perfil de liberação do NGF e a degradabilidade das matrizes. Por fim, foi produzido um sistema de liberação prolongado de NGF constituído por uma matriz tubular de nanofibras randomizadas na camada externa e alinhadas no lúmen. Os resultados obtidos indicam que as matrizes desenvolvidas, constituídas de nanofibras de PCL e PEG, apresentam potencial de aplicação como sistema de liberação de NGF e no estudo da regeneração nervosa periférica.

Abstract : Electrospinning is a promising technique to generate scaffolds for delivery systems and nerve tissue engineering. This study describes the development of a nanostructured matrix permissive to neural cell differentiation. Firstly, the effect of setting up parameters and collector design on the alignment and architecture of electrospinning fibers was studied. The process was optimized to obtain randomized and aligned nanofibers. Polycaprolactone (PCL) fibers were produced using three collectors: metallic rotating drum, copper wires, and a rotating mandrel. The drum collector produced a typical tridimensional structure whereby the rotational speed mechanically stretches fibers and affects their diameter and alignment. Randomly oriented fibers with an average diameter of 1142 ± 391 nm were obtained at 0 rpm, while aligned fibers with an average diameter of 663 ± 334 nm were produced at 2000 rpm. Static copper wires produced a novel fiber pattern in which the degree of orientation of the fibers was related to the electrical field distribution along the collector. Mandrel collector produced a tubular mat composed by nanofibers with an average diameter of 606 ± 329 nm. In a second series of experiments, the influence of polyethyleneglycol (PEG) on nanofibers composed of PCL and PEG blends was evaluated. Three types of PEG with t molecular weights (400, 1500, and 35000 Da) and concentrations (1, 5, and 10% ratio to PCL) were studied. Mats were characterized in terms of architecture by Scanning Electron Microscopy (SEM) and mechanical properties by uniaxial tensile tests using a texture analyser. The presence of PEG decreased the diameter and mechanical resistance of fibers. Cell culture studies have demonstrated the absence of cytotoxicity of these biomaterials. The suitability of using polyethylene glycol (PEG) to prolong the delivery of NGF incorporated into PCL electrospinning nanofibers was demonstrated. The effect of released nerve growth factor (NGF) from the mats was evaluated by neuronal differentiation using PC12 cells. Electrospun scaffolds composed by aligned nanofibers promoted alignment and neurite outgrowth of PC12 cells along the axis of the aligned nanofibers. PEG influenced positively the release profile of NGF and mats degradability. Finally, a sustained NGF deliver system composed by a tubular matrix of randomized nanofiber in the outer layer and aligned nanofibers in the lumen was produced. Therefore, the results obtained indicate that the developed matrix, composed by PCL and PEG nanofibers, present potential application as a NGF delivery system and in the study of the peripheral nervous regeneration.