Análise de biomarcadores proteicos para estudos de identificação, resistência e variabilidade em Staphylococcus spp. resistentes à meticilina (MRS) e Enterococcus resistentes à vancomicina (VRE)

Abstract

Nas últimas décadas, a disseminação de bactérias patogênicas e resistentes, tornou-se uma preocupação a nível mundial. As metodologias fenotípicas e moleculares tradicionais são laboriosas, requerem muito treinamento técnico e possuem altos custos. O sistema MALDI-TOF/MS, metodologia emergente da espectrometria de massas aplicada à microbiologia, é utilizado na rotina como método de identificação por inoculação direta de bactérias e mostrou-se promissor na determinação precoce da relação epidemiológica de isolados. Os Staphylococcus spp. resistentes à meticilina (MRS) e Enterococcus resistentes à vancomicina (VRE) são importantes patógenos oportunistas que causam Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS). Assim sendo, o nosso trabalho tem como objetivo analisar biomarcadores proteicos para estudos de identificação, resistência e variabilidade de isolados de MRS e VRE. Os isolados são provenientes do Hospital Universitário (HU/UFSC, Florianópolis/SC, Brasil), coletados entre abril de 2015 e março de 2016 de pacientes, profissionais da saúde, e ambiente hospitalar de cinco alas do hospital: Emergência (EMG), Unidade de Terapia Intensiva (UTI), Centro Cirúrgico (CCR), Clínica Médica I (CMI) e Clínica Cirúrgica I (CRI). Das 1.759 amostras coletadas, foram isolados 17 VRE e 72 MRS. Desses, catorze foram identificados como S. aureus resistentes à meticilina (MRSA) e quinze como E. faecium resistentes à vancomicina. Nossos resultados apontam que o protocolo de MALDI-TOF validado neste trabalho para análises microbiológicas mostrou poder discriminatório para identificação dos isolados a nível de gênero, tanto para VRE quanto para MRS, analisando-se proteínas na faixa de 2.000 a 20.000 Da. Para Staphylococcus spp., os biomarcadores proteicos identificados permitiram uma análise robusta para identificação das espécies, mas não mostraram poder discriminatório suficiente para análises de marcadores de resistência à oxacilina e vancomicina ou de variabilidade e clonalidade. Para a identificação dos Staphylococcus coagulase negativa (SCoN) foram encontrados quatro picos exclusivos para S. sciuri resistentes à oxacilina (MRSCi), quatro para S. haemolyticus resistentes à oxacilina (MRSH) e dezessete para S. warneri resistentes à oxacilina (MRSW). Na tentativa de diferenciar MRSA dos MSSA, foram obtidos nove picos com especificidade e sensibilidade consideráveis, mas somente dois, m/z 2302±2 Da e 3073±2 Da possuem valores relevantes da área sob a curva (AUC) para futuras pesquisas. No caso do VRE, o pico m/z 4430±3 Da foi comum para todas as amostras, entretanto não foi possível identificar picos comuns para identificação das espécies nem para estudos de prospecção de resistência bacteriana. Finalmente, apesar de bem estabelecido para identificação bacteriana, nossos dados sugerem cautela na interpretação dos resultados de MALDI-TOF/MS para estudos de resistência e variabilidade até que modelos computacionais estejam bem validados.

Abstract : Within the last decade, the characterization of pathogenic and resistant bacteria has become a worldwide concern. The conventional microbiology and molecular biology methods are time-consuming, require technical skills training and are costly. Matrix-assisted laser-desorption-ionization-time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS), an emerging methodology of mass spectrometry applied to microbiology, is a method routinely used for bacterial identification using a whole cell of bacteria and has shown promise in the prompt determination of epidemiological relatedness of clinical isolates. Methicillin-resistant Staphylococcus spp. (MRS) and vancomycin-resistant Enterococci (VRE) are important opportunistic pathogens that cause Healthcare-associated Infections (HAI). The aim of this study was to analyze protein biomarkers for bacterial identification, resistance and variability of MRS and VRE isolates compared to standard strains and control strains. The isolates were collected from the University Hospital (HU/UFSC, Florianópolis/SC, Brazil), between April 2015 and March 2016 from patients, health workers and the hospital environment of five hospital units: Emergency Department (ED), Intensive Care Unit (ICU), Surgical Center (SC), Medical Clinical Unit (MCU) and Surgical Clinical Unit (SCU). From the 1,759 samples that were obtained, 17 VRE and 72 MRS were isolated. Among then, fourteen were identified as methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and seventeen as vancomycin-resistant Enterococcus faecium. Here we show that the MALDI-TOF protocol validated in the study conditions for microbiological analysis showed discriminatory power for the identification of the isolates at the genus level, for both VRE and MRS, analyzing proteins in the range of 2,000 to 20,000 Da. The identified protein biomarkers to Staphylococcus spp. allowed a robust analysis for species identification. However, they did not show sufficient discriminatory power for analyzes of oxacillin and vancomycin resistance markers or of variability and clonality. For the identification of coagulase-negative staphylococci (CoNS), four unique peaks were found for methicillin-resistant S. sciuri (MRSCi), four for methicillin-resistant S. haemolyticus (MRSH) and seventeen for methicillin-resistant S. warneri (MRSW). In an attempt to differentiate MRSA from MSSA, nine peaks with considerable specificity and sensitivity were obtained, but only two, m/z 2302±2 and 3073±2 have relevant area under the curve (AUC) values for future research. In the case of VRE, the peak m/z 4430±3 was common for all samples; however it was not possible to identify common peaks for identification of the species or for prospective studies of bacterial resistance. Finally, although well established for bacterial identification, our data suggest caution in the interpretation of MALDI-TOF/MS results for studies of resistance and variability until computational models are well validated.