Atividade 7-etóxi-resorufina o-deetilase em ostras Crassostrea sp. e níveis de transcritos e atividades de enzimas de biotransformação em ostras Crassostrea gigas expostas a hidrocarbonetos policíclicos aromáticos

Abstract

Contaminantes ambientais podem ser metabolizados por enzimas que compõem o sistema de biotransformação. Esse sistema é constituído de enzimas de fase I, como as enzimas da superfamília citocromo P450 (CYP), e de fase II, composta por enzimas de conjugação, como glutationas S-transferases (GSTs) e sulfotransferases (SULTs). Em vertebrados, CYPs da família 1 (CYP1) possuem como substratos os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs). Esses compostos podem induzir um aumento na atividade de CYP1 e a atividade dessas enzimas é usualmente quantificada através do ensaio de 7-etóxi-resorufina O-deetilase (EROD). Apesar da ausência da família gênica CYP1 em animais protostômios, genes semelhantes à CYP1 (CYP1-like) e a atividade EROD foram detectados nesses organismos. Nos bivalves Crassostrea brasiliana (= Crassostrea gasar) e Crassostrea gigas, há evidências da presença de genes CYP1-like, apesar da atividade EROD não ter sido detectada até o momento. No presente estudo, a atividade EROD em C. brasiliana e C. gigas foi investigada. Além disso, os níveis de transcritos de genes e atividades de enzimas de biotransformação em C. gigas expostas aos HPAs pireno e fluoreno foram estudados. Em C. brasiliana, a atividade EROD foi detectada na fração microssomal de brânquias e glândula digestiva. A temperatura e o pH do ensaio foram estabelecidos em 30 oC e 7,4, respetivamente. O Km aparente (Kmapp) da enzima foi 4,32 µM para as brânquias e 5,56 µM para a glândula digestiva. A velocidade máxima (Vmax) foi 337,3 fmol.min-1.mg de proteína-1 nas brânquias e 297,7 fmol.min-1.mg de proteína-1 na glândula digestiva. A atividade EROD foi inibida em ambos os tecidos pelo inibidor de CYP1 elipticina, sugerindo que uma enzima CYP1-like esteja catalisando a atividade EROD. Em C. gigas, a atividade EROD foi detectada apenas nas brânquias e a caracterização cinética demonstrou um Kmapp de 1,15 µM e Vmax de 229,2 fmol.min-1 mg.proteína-1. O inibidor clotrimazol e o surfactante Triton X-100 inibiram a atividade EROD em C. gigas. Os níveis de transcritos dos genes CYP1-like 1 e 2, analisados em conjunto, se correlacionaram positivamente com a atividade EROD das brânquias. Os modelos de homologia desses genes apresentaram o enovelamento característico de CYP e a ancoragem molecular demonstrou que essas estruturas possuem potencial para metabolizar o substrato 7-etóxi-resorufina. Os níveis de transcritos dos genes CYP1-like, CYP2-like, CYP2AU2, CYP356A1, CYP17a-like, GSTO-like, GSTmic-like e SULT-like e as atividades de enzimas de biotransformação EROD, GST total e GST microssomal (GSTmic) foram analisados nas brânquias de C. gigas expostas a 50 e 100 µg/L de pireno ou 100 e 200 µg/L de fluoreno por 24 e 96 h. A atividade GSTmic foi maior nas brânquias de ostras expostas a 100 µg/L de pireno em relação aos demais grupos de exposição ao pireno após 96 h. Os níveis de transcritos dos genes CYP2AU2, GSTO-like e SULT-like foram maiores nos animais expostos a 200 µg/L de fluoreno em relação aos demais grupos de exposição ao fluoreno após 24 h. Em conclusão, a atividade EROD é possivelmente catalisada por enzimas CYP1-like em ostras C. brasiliana e C. gigas e a exposição ao fluoreno alterou os níveis de transcritos de genes de biotransformação, entretanto, o mecanismo pelo qual o fluoreno alterou esses níveis permanece para ser elucidado.

Abstract : Environmental contaminants can be metabolized by biotransformation enzymes. This system consists of phase I enzymes, as cytochrome P450 (CYP) superfamily, and phase II conjugating enzymes, as glutathione S-transferases (GSTs) and sulfotransferases (SULTs). In vertebrates, polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are substrates of cytochrome P450 family 1 (CYP1) and can induce CYP1 enzyme activity, which is usually quantified as 7-ethoxyresorufin O-deethylase activity (EROD). CYP1 gene family is not present in protostomes organisms, although CYP1-like genes and EROD activity have been detected in these organisms. There are evidences of CYP1-like genes in the bivalves Crassostrea brasiliana (= Crassostrea gasar) and Crassostrea gigas, but no EROD activity has been detected in these organisms. The aim of this study was to investigate the presence of EROD activity in the bivalve mollusks C. brasiliana and C. gigas. In addition, transcript levels and activities of biotransformation enzymes were analyzed in oyster C. gigas exposed to the PAHs pyrene and fluorene. In C. brasiliana, EROD activity was detected in gills and digestive gland microsomal fraction. Temperature and pH for EROD assay were established as 30 oC and 7.4, respectively. EROD apparent Km (Kmapp) was 4.32 µM for gills and 5.56 µM for digestive gland. EROD Vmax was 337.3 fmol.min-1.mg of protein-1 in gills and 297.7 fmol.min-1.mg of protein-1 in digestive gland. CYP1 inhibitor ellipticine (ELP) inhibited EROD in both tissues, suggesting that a CYP1-like enzyme is catalyzing EROD activity. In C. gigas, EROD activity was detected only in gills. EROD kinetic characterization demonstrated a Kmapp of 1.15 µM and Vmax of 229.2 fmol.min-1 mg.protein-1. Clotrimazole and the surfactant Triton X-100 inhibited EROD activity in C. gigas. Transcript levels of CYP1-like 1 and 2, analyzed together, positively correlated with EROD activity observed in gills. Homology models of these genes exhibited a typical CYP fold and molecular docking showed that these structures have potential to metabolize the substrate 7-ethoxyresorufin. CYP1-like, CYP2-like, CYP2AU2, CYP356A1, CYP17a-like, GSTO-like, GSTmic-like and SULT-like genes transcript levels and EROD, total GST and microsomal GST (GSTmic) biotransformation enzymes activity were analyzed in gills of C. gigas exposed to 50 and 100 µg/L of pyrene and 100 and 200 µg/L of fluorene for 24 and 96 h. GSTmic activity were higher in gills of oyster exposed to 100 µg/L of pyrene compared to the remaining experimental groups after 96 h of exposure. CYP2AU2, GSTO-like and SULT-like transcript levels were higher in oysters exposed to 200 µg/L of fluorene compared to others groups exposed to fluorene after 24 h. In conclusion, EROD activity is possibly catalyzed by CYP1-like enzymes in oyster C. brasiliana and C. gigas and fluorene exposure have an effect upon biotransformation genes transcript levels, although the mechanism which fluorene affect transcript levels in C. gigas remains to be elucidated.