Desenvolvimento de scaffold de nanocelulose bacteriana com modificação de superfície para aplicações tópicas

Abstract

A Engenharia de tecidos é uma abordagem com particular relevância no tratamento de feridas, pois é considerada uma tecnologia biomédica promissora que visa a regeneração de tecidos danificados. No entanto, barreiras para a utilização de biomateriais como substituintes de tecidos incluem a adesão de células ao arcabouço exógeno e a proliferação destas, muitas vezes limitando o seu uso. Visando o desenvolvimento de scaffolds funcionais para aplicações tópicas, esta tese está dividida em duas partes: a primeira está relacionada ao desenvolvimento de um scaffold de nanocelulose bacteriana (BNC) com superfície modificada pela adsorção de Poli-L-Lisina-Colesterol (PLC), aqui denominado BNC-PLC. O objetivo principal desta parte é modificar eletrostaticamente a superfície da BNC, para favorecer a interação com as células. O polímero PLC, recém sintetizado e ainda inédito na literatura, foi caracterizado quanto à ressonância magnética nuclear (RMN), espalhamento dinâmico de luz (DLS) e mobilidade eletroforética. O scaffold foi desenvolvido e caracterizado quanto à espectroscopia de infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) e microscopia de força atômica (AFM). A biocompatibilidade da BNC- PLC foi analisada através do teste de citotoxicidade direta em fibroblastos L929 e através das análises da morfologia, atividade metabólica, adesão celular e expressão gênica por RT-PCR em tempo real de fibroblastos humanos primários cultivados sobre as membranas. Quanto à caracterização da PLC, os espectros de RMN confirmaram a presença do grupo colesterol ligado covalentemente à lisina, na proporção de 30%. A análise de DLS confirmou a formação de nanopartículas de diâmetro hidrodinâmico médio em 59 nm e índice de polidispersão de 0,427 em solução aquosa, O potencial zeta apresentado foi de 48 mV. As análises para caracterização da BNC-PLC confirmaram a presença do polímero adsorvido na superfície da membrana e ausência de nanopartículas depositadas, indicando que o polímero se desenovela e expõe as moléculas de colesterol sobre as fibras da BNC. As análises de biocompatibilidade revelaram a ausência de toxicidade e aumento da atividade metabólica e adesão de fibroblastos humanos primários. A análise por PCR em tempo real indicou um aumento significativo da expressão de colágeno, integrina a1 e integrina a2 nos fibroblastos cultivados sobre a BNC-PLC comparado à BNC. Dadas as suas características e compatibilidade celular, o scaffold desenvolvido apresenta potencial para a regeneração tecidual da pele, mais especificamente para aplicação tópica no tratamento de feridas. A segunda parte desta tese descreve os resultados da elaboração e execução de um protocolo de estudo clínico fase I para a avaliar a segurança de aplicação tópica de membranas de nanocelulose bacteriana. Neste estudo foram utilizadas como modelo membranas de BNC incorporadas com Aloe vera, aqui denominadas BNC-Aloe. No teste de segurança e inocuidade da BNC-Aloe, observou-se que nenhuma das pessoas voluntárias desenvolveu qualquer sinal e sintoma de alergia ao produto. A pele no local de aplicação manteve-se íntegra, sem a presença de eritema, ressecamento, descamação, calor, bolhas, relatos de dor ou prurido. Os resultados dos parâmetros bioquímicos do sangue e urinálise também não apresentaram alteração significativa. Diante do exposto, não houveram evidências clínicas de toxicidade da membrana BNC-Aloe e conclui-se que o biomaterial desenvolvido é seguro para aplicação em humanos.

Abstract : Tissue engineering is a particularly relevant approach to wound treatment, as it is a promising biomedical technology aimed at regenerating damaged tissue. However, barriers to the use of biomaterials as tissue substituents include cell adhesion to the exogenous scaffold and proliferation, often limiting its use. Aiming at the development of functional scaffolds for topical applications, this thesis is divided into two parts: the first one is related to the development of a scaffold of bacterial nanocellulose (BNC) for topical application, with surface modification by the adsorption of Poly-L- lysine-cholesterol (PLC), herein called BNC-PLC. The main objective of this part is to electrostatically modify the surface of BNC, to improve the interaction with cells. The recently synthesized polymer PLC has been characterized by nuclear magnetic resonance (NMR), dynamic light scattering (DLS) and electrophoretic mobility. The scaffold was developed and characterized by Fourier Transform Infrared (FTIR) spectroscopy and atomic force microscopy (AFM). The biocompatibility of BNC-PLC was analyzed by the direct cytotoxicity test in L929 fibroblasts and through analyzes of cell morphology, metabolic activity, adhesion and gene expression by real-time RT-PCR of primary human fibroblasts cultured on the membranes. As for PLC characterization, the NMR spectra confirmed the presence of the cholesterol group covalently bound to lysine in the proportion of 30%. The DLS analysis confirmed the formation of nanoparticles with average hydrodinamic diameter of 59nm with polidispersion index of 0,427 in aqueous solution and zeta potential of 48 mV. The BNC-PLC characterization confirmed the presence of the polymer adsorbed on the surface of the membrane and absence of nanoparticles deposited on the surface of the BNC, indicating that the polymer adsorbs to the surface and exposes the cholesterol molecules. Biocompatibility analyzes revealed the absence of toxicity and increased metabolic activity and adhesion of primary human fibroblasts. Real-time PCR analysis indicated a significant increase in the expression of collagen, a1 integrin and a2 integrin in fibroblasts cultured on BNC-PLC compared to BNC. Given its characteristics and cellular compatibility, the developed scaffold presents potential for the tissue regeneration of the skin, more specifically for topical application in wound healing purposes. The second part os this thesis describes the results of the elaboration and execution of a phase I clinical study protocol to evaluate the safety of topical application of bacterial nanocellulose membranes. In this study BNC membranes incorporated with Aloe vera, herein denominated BNC-Aloe, were used as sample model. In the safety and harmlessness test of BNC-Aloe, it was observed that none of the volunteers developed any signs and symptoms of allergy to the product. The skin at the application site remained intact without the presence of erythema, dryness, scaling, heat, blisters, reports of pain or itching. The results of the blood biochemical parameters and urinalysis also did not present significant alteration. Therefore, there was no clinical evidence of BNC-Aloe membrane toxicity and it could be concluded that the developed biomaterial is safe for human application.