Quantificação de cocaína e seu produto de biotransformação, benzoilecgonina, em amostras de cabelo: desenvolvimento, validação e aplicação de método

Abstract

O consumo da cocaína (COC) segue aumentando no Brasil, tornando-se maior a preocupação da área de segurança pública. Neste contexto, a toxicologia forense utiliza cada vez mais as amostras não convencionais como o cabelo (CB), que apresenta vantagens como longa janela de detecção e viabilidade de coleta em cadáveres com estágio avançado de decomposição. Assim, este estudo propõe desenvolvimento, validação e aplicação de uma metodologia para quantificação de COC e benzoilecgonina (BE) em amostras de CB, empregando a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) com Detector de Arranjo de Diodos (DAD). O preparo da amostra iniciou com as etapas de lavagem e fragmentação, avaliando o emprego de agente emulsificador e pulverização, respectivamente. Na digestão do CB avaliou-se 4 soluções: metanol, HCl 0,1 M, solução metanólica de HCl 0,1 M e metanol com HCl 0,1 M. Todas foram mantidas à 45 ºC por 16 horas. O sobrenadante foi submetido a Extração em Fase Sólida (EFS). Nesta avaliou-se o pH da amostra e do tampão utilizado, assim como o eluente. Considerando a CLAE foram avaliados o tipo e proporção dos solventes, modo de eluição e fluxo da fase móvel (FM). A validação contemplou: linearidade, limite de detecção (LD) e quantificação (LQ), precisão e exatidão, recuperação, especificidade/seletividade e efeito memória. O método foi aplicado em 22 amostras de CB de casos atendidos no Instituto Geral de Perícias de Santa Catarina (IGP/SC). Como resultado, para a lavagem foi utilizado tween 80 0,1 % e diclorometano em banho de ultrassom. A fragmentação foi realizada com tesoura seguida de pulverização com gral e pistilo. A melhor solução digestora foi a mistura de metanol com HCl 0,1 M. Para a EFS utilizou-se pH 6 para amostra e tampão, e o solvente de escolha foi hidróxido de amônio 5% em metanol. Para a CLAE, obteve-se: acetonitrila:acetato de amônio 10 mM (FM) com eluição em modo gradiente na proporção 13:87 a 80:20 em 13 min; fluxo de 0,6 mL/min. Quanto à validação, o método foi linear na faixa de trabalho selecionada. Os LD e LQ em ng/mg de CB obtidos para BE e COC foram: 0,28; 0,27 e 0,95; 0,91. Para a precisão obtiveram-se coeficientes de variação (CVs) médios de 11,68 % (BE) e 7,41 % (COC). As exatidões médias foram de 94,8 (BE) e 97,63 (COC), e as recuperações médias, 85,63 (BE) e 80,36 (COC). Na especificidade/seletividade nenhum dos 15 compostos avaliados apresentou tempo de retenção (TR) semelhante aos da COC e BE, no entanto, amostras com tinta preta apresentaram interferência que inviabilizou a análise. No efeito memória observou-se contaminação a partir de 50 µg/mL eliminada com alterações na lavagem do amostrador automático. Das 22 amostras reais, em 7 não foi detectado nenhum dos analitos de interesse em uma delas apenas COC e em outra apenas BE. Nas 13 restantes foram detectadas BE e COC, variando as concentrações de 2,33 a 123,03 µg/mg de BE e 2,17 a 127,05 µg/mg de COC. Diante do exposto pode-se inferir que o desenvolvimento das etapas pré-analíticas e analíticas foram importantes para o método proposto e validado, tornando-o passível de implementação na rotina de um laboratório forense. O trabalho ainda proporcionou a criação de um Procedimento Operacional Padrão (POP), a ser disponibilizado ao IGP/SC. Ao analisar as amostras de CB de casos reais observou-se as duas principais vantagens desta amostra, sua longa janela de detecção e a viabilidade de coleta e análise quando as amostras convencionais não estão disponíveis. Esses achados, já conhecidos da comunidade científica, reforçam a importância da utilização de tais amostras como alternativa na toxicologia forense.

Abstract : The cocaine (COC) use continues to increase in Brazil. This becoming a concern in public security area. In this context, forensic toxicology increasingly uses unconventional samples such as hair. Those in contrast to the most usual samples, have advantages. An example is the long detection window and their viability even in cadavers in an advanced stage of decomposition. Thus, the present work proposes the development, validation, and application of a methodology for quantification of COC and benzoylecgonine (BE), in hair samples, using High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) with Diodes Array Detector (DAD). Sample preparation started with washing and fragmentation stages. In these was evaluating the variables, emulsifying agent use and sample pulverization, respectively. For hair digestion, 4 solutions were analyzed: methanol, 0.1 M HCl, 0.1 M HCl methanolic solution and methanol with 0.1 M HCl. All were kept at 45 °C for 16 hours. After, the liquid phase was subjected to Solid Phase Extraction (SPE) and the pH of the sample and the buffer used, as well as the eluent, were evaluated. Considering the HPLC, the type and proportion of the solvents, elution mode and mobile phase (MP) flow were evaluated. The validation included: linearity, limit of detection (LD) and quantification (LQ), precision, accuracy, recovery, specificity/selectivity and carryover. The method was applied to 22 hair samples from victims of cases attended at the Instituto Geral de Perícias de Santa Catarina (IGP/SC). As result, for washing step was using tween 80 0.1 % and dichloromethane in an ultrasonic bath. The fragmentation was performed with scissors followed by pulverization with pestle and mortar. The best digestion solution was the methanol mixture with 0.1 M HCl. For SPE the pH chosen for sample and buffer was 6 and elution solvent was 5 % ammonium hydroxide in methanol. For HPLC, the MP was acetonitrile:ammonium acetate (10 mM). The elution mode was a gradient starting with 13:87 to 80:20 in 13 min; flow rate of 0.6 mL/min. About validation, the method was linear in the working range. The LD and LQ in ng/mg of hair obtained for BE and COC were: 0.28; 0.27 and 0.95; 0.91, respectively. For precision, the relative standard deviation (RSD) of 11.68 % (BE) and 7.41 % (COC) were obtained. The accuracy were 94.8 (BE) and 97.63 (COC), and mean recoveries were 85.63 (BE) and 80.36 (COC). In the specificity/selectivity, none of the 15 compounds evaluated had retention time (RT) similar to those of COC and BE. However, dyed samples presented interference that made analysis impossible. In carryover, contamination after analysis of a 50 µg/mL concentration was observed. That was eliminated with changes in automatic sampler parameters. For the 22 real samples analyzed, in 7 no COC or BE was detected, in one of them only COC and in another just BE. In the remaining 13, BE and COC were detected, and the concentrations range was 2.33 to 123.03 µg/mg of hair (BE) and 2.17 to 127.05 µg/mg of hair (COC). All things considered, it can be inferred that the development of pre-analytical and analytical steps was important for the validated method, that can be implemented in the routine of a forensic laboratory. The work also provided a standard operating procedure, that is available to the IGP/SC. About samples from IGP/SC at its headquarters in Joinville was observed the two main advantages of the unconventional samples. First, their long detection window and second, the analysis viability at times when most usual samples are not available. These findings, already known by the scientific community, reinforce the importance of using such samples as an alternative to forensic toxicology.