Bionanocellulose: new methods for biofilm production and high-quality bacterial RNA extraction

Abstract

Abstract : Bionanocellulose, also known as bacterial nanocellulose (BNC), has become an important biomaterial for industrial, technological and biomedical applications. Komagataeibacter hansenii ATCC 23769 produces a microstructured BNC biofilm arranged in a 3D network of nanofibrils. Despite its biotechnological relevance, and the fact that the advances of the omics techniques and next-generation technologies have opened a new age in the study of biological systems, this organism has not been investigated at the molecular level and neither the transcriptome assembly nor the genome-scale metabolic model of K. hansenii have been elucidated. In this study, we address specifically the bottlenecks of current state of i) transcriptome and ii) metabolic applications in bionanocellulose biofilm production studies. The main challenges associated with those gaps are: i) the difficulty to obtain high-quality RNA from bacteria cells in nanocellulose biofilms due its large contents of polysaccharides and fibers and ii) the need to obtain precise metabolic measures which is a problem when complex culture media is used in the process. First, we developed an optimized extraction method to obtain high-quality RNA from K. hansenii cells living/producing BNC biofilms. The method is based on different cell disruption techniques in combination with RNA extraction reagents. For successful isolation of intact RNA, an efficient DNase treatment was performed to remove genomic DNA and guarantee pure RNA samples. The method was evaluated by the quality, quantity and the integrity of RNA samples and it is the first to allow the isolation of highly concentrated and intact RNA from K. hansenii cells in BNC biofilms and planktonic states. The developed RNA extraction method that consistently yields high-quality RNA samples can now be used to perform RNA-Sequencing studies allowing gene expression analysis and consequently improving the understanding of BNC synthesis. The second problem we tackle within the current study was the development of a defined minimal culture medium (DMCM) for BNC production. The most common culture medium used to produce BNC is a complex medium that contains yeast extract and peptone thus has undefined chemical composition. The designed DMCM medium is a composed of seven components, disodium phosphate, monopotassium phosphate, sodium chloride, magnesium sulfate, calcium chloride, ammonium chloride as nitrogen source, and glucose as carbon source. Different carbon and nitrogen sources were tested, varying their concentrations and results revealed 25 mM of glucose and 10 mM of NH4Cl as best fitted concentrations and carbon and nitrogen sources. Moreover, the developed DMCM culture medium can now be utilized to obtain experimental data to support future in silico metabolic investigations for the better understanding of bionanocellulose production by identifying the metabolic capacities and the behavior of the bacterium in terms of growth, nutrient demand and generation of extracellular metabolites. Additionally, the membranes synthesized in DMCM showed a previously unknown transparency, which has not been reported yet without the addition of other substances. The characterization of BNC? Minimal membranes revealed important improvements in some properties such as higher water holding capacity, highly porous surface and better elasticity than the usual membranes. Thus, the defined minimal culture medium proposed here can be exploited to synthesize novel transparent BNC membranes with unique properties of considerable interest to several applications in the biomedical and industrial fields.

A bionanocelulose, também conhecida como nanocelulose bacteriana (BNC), tornou-se um importante biomaterial para aplicações industriais, tecnológicas e biomédicas. Komagataeibacter hansenii ATCC 23769 produz um biofilme de BNC microestruturado e organizado em nanofibras. Apesar de sua relevância biotecnológica, e o fato de que os avanços das técnicas de ômicas e tecnologias de próxima geração abriram uma nova era no estudo dos sistemas biológicos, este organismo não foi investigado à nível molecular e nem a montagem do transcriptoma nem o modelo metabólico em escala genômica de K. hansenii foi esclarecido. Neste estudo, abordamos especificamente os gargalos do estado atual do i) transcriptoma e ii) aplicações metabólicas em estudos de produção de biofilme de nanocelulose. Os principais desafios associados a esses gaps são: i) a dificuldade de obter RNA de alta qualidade de células de bactérias em biofilmes de nanocelulose devido a grande quantidade de polissacarídeos e fibras e ii) a necessidade de obter medidas metabólicas precisas, o que é um problema quando um meio de cultura complexo é usado no processo. Primeiro, desenvolvemos um método de extração otimizado para obter RNA de alta qualidade de células de K. hansenii que vivem / produzem biofilmes de BNC. O método é baseado em diferentes técnicas de ruptura celular em combinação com reagentes de extração de RNA. Para o isolamento bem-sucedido de RNA intacto, foi realizado um tratamento de DNase eficiente para remover DNA genômico e garantir amostras de RNA puro. O método foi avaliado pela qualidade, quantidade e integridade das amostras de RNA e é o primeiro a permitir o isolamento de RNA altamente concentrado e intacto de células de K. hansenii em biofilmes e em estado planctônico. O método de extração de RNA desenvolvido que produz consistentemente amostras de RNA de alta qualidade agora pode ser usado para sequenciamento permitindo a análise da expressão gênica e consequentemente melhorando a compreensão da síntese de BNC. O segundo problema que abordamos no presente estudo foi o desenvolvimento de um meio de cultura mínimo definido (DMCM) para a produção de BNC. O meio de cultura mais comum usado para produzir BNC é um meio complexo que contém extrato de levedura e peptona, portanto, possui composição química indefinida. O meio DMCM desenvolvido é composto por sete componentes, fosfato dissódico, fosfato monopotássico, cloreto de sódio, sulfato de magnésio, cloreto de cálcio, cloreto de amônio como fonte de nitrogênio e glicose como fonte de carbono. Diferentes fontes de carbono e nitrogênio foram testadas, variando suas concentrações e os resultados revelaram 25 mM de glicose e 10 mM de NH4Cl como as melhores concentrações e fontes de carbono e nitrogênio. Além disso, o meio de cultura DMCM desenvolvido agora pode ser utilizado para obter dados experimentais para apoiar futuras pesquisas metabólicas in silico para uma melhor compreensão da produção de bionanocelulose, identificando as capacidades metabólicas e o comportamento da bactéria em termos de crescimento, demanda de nutrientes e geração de metabolitos extracelulares. Além disso, as membranas sintetizadas em DMCM mostraram uma transparência previamente desconhecida, que não foi relatada sem a adição de outras substâncias. A caracterização das membranas BNC?Mínimo revelou melhorias importantes em algumas propriedades, como maior capacidade de retenção de água, superfície altamente porosa e melhor elasticidade do que as membranas usuais. Assim, o meio de cultura definido proposto aqui pode ser explorado para sintetizar membranas de bionanocelulose transparentes com propriedades únicas de interesse considerável para várias aplicações nos campos biomédico e industrial. Em resumo, este estudo desenvolveu novos métodos para a extração de RNA bacteriano de alta qualidade e para a produção de biofilmes que permitirão o uso em análises transcriptômicas e metabolômicas para a compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na biossíntese BNC. O método de extração de RNA otimizado foi desenvolvido para produzir amostras de RNA com quantidade, pureza e integridade das células de K. hansenii que vivem / produzem biofilmes de BNC. A partir de amostras de RNA de alta qualidade de K. hansenii em biofilmes e em estado planctônico, a montagem do transcriptoma poderá ser realizada para identificar genes alvo que têm um alto impacto na síntese de BNC. Em relação ao meio de cultura mínimo definido desenvolvido, esse estudo comprovou a capacidade de K. hansenii em sintetizar BNC com limitação de nutrientes. DMCM pode fornecer análises metabólicas precisas e maior reprodutibilidade experimental em comparação com meios complexos.