Avaliação do efeito de compostos isolados da alga marinha Dictyopteris jolyana sobre a agregação plaquetária

Abstract

A trombose é um importante problema de saúde pública, uma vez que apresenta elevada incidência, morbidade e mortalidade. Os eventos trombóticos podem ser prevenidos e tratados com medicamentos antiagregantes ou anticoagulantes, no entanto, essas terapias têm limitações associadas, o que restringe o seu uso em algumas situações. Nesse contexto, os produtos naturais são uma área de interesse hoje e o ambiente marinho representa uma fonte de novas moléculas bioativas. Portanto, aqueles compostos que apresentam ação sobre a hemostasia humana sem quase nenhum potencial citotóxico podem representar um avanço no desenvolvimento de novos fármacos antitrombóticos e anticoagulantes, e auxiliar no tratamento e prevenção de eventos tromboembólicos. Diante disso, este trabalho teve como objetivo investigar o efeito sobre a hemostasia de um extrato bruto (EDJ), cinco frações (FDJ1-5) e dois compostos isolados (IDJ1-2) provenientes da alga marinha parda Dictyopteris jolyana. A atividade sobre a coagulação foi avaliada pelos testes de tempo de protrombina (TP) e tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa). A ação antiagregante foi avaliada por turbidimetria utilizando-se ADP, epinefrina, ácido araquidônico (AA), colágeno ou fator de ativação plaquetária (PAF) como agonistas. Previamente à realização dos ensaios, as amostras de plasma pobre ou rico em plaquetas foram incubadas a 37 °C com EDJ, FDJ1-5, IDJ1-2 ou o veículo de dissolução (DMSO). EDJ não apresentou atividade anticoagulante significativa. No entanto, EDJ promoveu inibição significativa da agregação plaquetária induzida por ADP e epinefrina, e foi capaz de reverter parcialmente a primeira onda de agregação induzida por ADP. As frações e os compostos isolados também inibiram significativamente a agregação plaquetária. O composto IDJ1 teve CI50 de 441,5 ± 4,8 µM para ADP, 407,3 ± 7,0 µM para epinefrina, 319,2 ± 7,5 µM para colágeno e 410,4 ± 6,7 µM para PAF. IDJ2 apresentou menor atividade antiagregante, com CI50 de 476,1 ± 13,8 µM para epinefrina e maior que 500 µM para os demais agonistas. Os perfis das curvas de agregação indicam que o efeito inibitório de IDJ1 e IDJ2 está associado à inibição da segunda onda de agregação, o que sugere que IDJ1-2 estejam inibindo a ativação plaquetária através da inibição do receptor de ADP do tipo P2Y12 e de suas vias de sinalização. O efeito de IDJ1-2 sobre a ativação plaquetária foi avaliado por citometria de fluxo através da expressão de PAC1 e da expressão membranar de P-selectina. Os compostos IDJ1-2 inibiram em mais de 50 % a expressão desses marcadores, comprovando que sua atividade está relacionada com a inibição da ativação plaquetária. O efeito citotóxico de IDJ1-2 foi avaliado pelo teste de hemólise e efeito na viabilidade de células mononucleares saudáveis. IDJ1-2 causaram pequena hemólise e citotoxicidade significativa, contudo ao compará-los com fármacos de referência, conclui-se que esses resultados não inviabilizam futuros testes in vivo. Estudos in silico predizem que IDJ1-2 possuem potencial de biodisponibilidade oral segundo a regra dos cinco proposta por Lipinski. A compilação dos resultados evidencia a utilização de moléculas provenientes de D. jolyana como protótipos no desenvolvimento de novos fármacos antitrombóticos.

Abstract : Thrombosis is an important public health problem, due to it high incidence, morbidity and mortality. Thrombotic events can be prevented and treated with antiplatelet medications or anticoagulants, however, these therapies have associated limitations, which restricts their use in some situations. In this context, natural products are an area of interest today and the marine environment represents a source of new bioactive molecules. Therefore, those compounds that act on human hemostasis with low cytotoxic potential can represent an advance in the development of new antithrombotic drugs and anticoagulants, and help in the treatment and prevention of thromboembolic events. The aim of this work was to investigate the effect on hemostasis of a crude extract (EDJ), five fractions (FDJ1-5) and two isolated compounds (IDJ1-2) from the brown seaweed Dictyopteris jolyana. Clotting activity was assessed by prothrombin time (PT) and activated partial thromboplastin time (aPTT). The antiplatelet activity was evaluated by turbidimetry using ADP, epinephrine, arachidonic acid (AA), collagen or platelet activation factor (PAF) as agonists. Prior to the assays, samples of poor or platelet-rich plasma were incubated at 37 ºC with EDJ, FDJ1-5, IDJ1-2 or the dissolution vehicle (DMSO). EDJ did not present significant anticoagulant activity. However, EDJ promoted significant inhibition of platelet aggregation induced by ADP and epinephrine, and was able to partially reverse the first wave of ADP-induced aggregation. Fractions and isolated compounds also significantly inhibited aggregation. Compound IDJ1 had IC50 of 441.5 ± 4.8 µM for ADP, 407.3 ± 7.0 µM for epinephrine, 319.2 ± 7.5 µM for collagen and 410.4 ± 6.7 µM for PAF. IDJ2 presented lower antiplatelet activity, with IC50 of 476.1 ± 13.8 µM for epinephrine and greater than 500 µM for the other agonists. The aggregation curve profiles suggest that the inhibitory effect of IDJ1 and IDJ2 is associated with inhibition of the second wave of aggregation, which suggests that IDJ1-2 is inhibiting platelet activation through inhibition of the P2Y12-type ADP receptor and its pathways signaling. The effect of IDJ1-2 on platelet activation was assessed by flow cytometry through expression of PAC1 and membrane expression of P- selectin. IDJ1-2 compounds inhibited the expression of markers by more than 50 %, proving that their activity is related to the inhibition of platelet activation. The cytotoxic effect of IDJ1-2 was assessed by the hemolysis test and effect on viability of healthy mononuclear cells. IDJ1-2 caused small hemolysis and significant cytotoxicity, however when comparing with reference drugs, it was concluded that these results do not impair future in vivo testing. In silico studies predict that IDJ1-2 possesses oral bioavailability potential according to the "rule of five" proposed by Lipinski. The compilation of the results shows the potential use of molecules from D. jolyana as prototypes in the development of new antithrombotic drugs.