Caracterização de uma proteína da família das ligantes intracelulares de lipídeos (iLBP) como uma proteína ligante de ácidos graxos do tipo FABP2 em Crassostrea gigas: implicações ecotoxicológicas

Abstract

O crescimento desordenado da população humana, a falta de planejamento e tratamento de esgoto adequado tem como consequência a contaminação aquática. Os chamados PPCPs, ou produtos farmacêuticos e de cuidados pessoais estão entre os contaminantes mais comuns do litoral brasileiro. Os anti-inflamatórios não esteroidais, como o ibuprofeno, fazem parte desse grupo. Estudos prévios realizados pelo nosso grupo de pesquisa apontaram uma superexpressão de vários genes na ostra do Pacífico, Crassostrea gigas, quando exposta aos contaminantes, entre eles, um gene que expressa uma isoforma da proteína ligante de ácidos graxos (FABP). Sendo assim, é importante elucidar sua função no metabolismo de xenobióticos e seu possível potencial como biomarcador de contaminação aquática. Neste trabalho foi feita a caracterização da FABP de C. gigas, homóloga a FABP2 ou intestinal de vertebrados com experimentos in silico para construção de um modelo 3D da estrutura da proteína e análises de atracamento molecular (docking) com o ligante endógeno palmitato e o xenobiótico ibuprofeno. Para os testes de validação in vitro, a FABP foi clonada em vetor de expressão e purificada usando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). A proteína purificada foi usada para experimentos de dicroísmo circular e fluorescência. As análises por docking da FABP mostraram que o ibuprofeno liga-se formando ponte de hidrogênio com o resíduo Arg112, o mesmo responsável pela ligação com o palmitato, o que indica potencial competição pelo sítio de ligação. Os dados do CD corroboram os resultados in silico, porém mostram que o palmitato têm uma afinidade de ligação 10 vezes superior à do ibuprofeno, indicando que é necessário uma alta quantidade do fármaco para um deslocamento na ligação. Os dados sugerem que ibuprofeno possa ser um potencial ligante de FABP, porém mais estudos in vitro são necessários.

The rapid increase of human population and the lack of adequate sewage treatment result in contamination of water resources. Pharmaceuticals and personal care products (PPCPs) are a group of emerging environmental contaminants. Non-steroidal anti-inflammatories (NSAIDs) such as ibuprofen are part of this group. Previous studies conduced by our research team indicated that the Pacific oyster Crassostrea gigas has overexpression of several genes when exposed to aquatic contaminants as ibuprofen. One of these genes encoding an isoform of a fatty acid binding protein (FABP). Therefore, it is important to characterize the FABP of C. gigas to understand the FABP function in the metabolism of xenobiotics and the potential use as a biomarker of aquatic contamination. In the present study, the characterization of the FABP of C. gigas, homologous to FABP2 of vertebrates, was done with in silico experiments to construct a 3D model of the protein structure and molecular docking analyzes with the natural ligand palmitate and the xenobiotic ibuprofen. Also, the FABP was cloned into bacterial vector for expression and purified using high performance liquid chromatography (HPLC). The purified protein was used for circular dichroism and fluorescence experiments The molecular docking of FABP showed that ibuprofen forms a hydrogen bond with the Arg112 residue. The same residue is responsible for the hydrogen bond with the palmitate, indicating that there is competition for the binding site between the ligands. The CD data corroborates with in silico results, however it has been shown that palmitate has a binding affinity 10 times higher than ibuprofen, indicating that a high amount of drug is required for a displacement in palmitate binding. The data suggests ibuprofen as a potential binder of FABP, however, more in vitro further studies is needed to elucidate the relation between the FABP and PPCPs in C. gigas.