Estudo in vitro do potencial antitumoral de novos derivados de imidazo[1,2-a]piridinas seleniladas

Abstract

Tanto as imidazo[1,2-a]piridinas quanto os compostos organosselênicos demonstram alto potencial antitumoral contra diversas linhagens tumorais em estudos in vitro e in vivo, sendo propícia sua fusão em uma única molécula. Desta forma, onze novos derivados de imidazo[1,2-a]piridinas, sendo dez deles selenilados, foram testadas quanto ao seu potencial citotóxico, por meio do teste do MTT, contra duas linhagens tumorais (MCF-7 e HeLa) e uma linhagem de fibroblasto murinho (McCoy), definindo-se a CI50 para os onze compostos (0-1000 µM), selecionando-se os compostos com CI50 menores. Ensaios moleculares com espectrofotometria UV visível e com fluorescência (iodeto de propídio) foram realizados para avaliar a interação e a intercalação dos compostos selecionados (50-250 µM) com CT-DNA (150 µM). O teste do cometa para avaliar a fragmentação do DNA, o ensaio clonogênico e análise do ciclo celular para avaliar a atividade antiprolieferativa, a análise de morte celular (iodeto de propídio/laranja de acridina) para avaliar o tipo de morte induzido pelos compostos selecionados em células MCF-7 foram realizados após 72h de tratamento em concentrações subtóxicas, a CI30. A imunoeletroforese para avaliar a expressão de proteínas relacionadas ao dano de DNA, ciclo celular e apoptose foi realizada após o tratamento de 48h. Os compostos IP-Se-05 (CI50 = 26 µM/ MCF-7) e IP-Se-06 (CI50 = 12,5 µM/ MCF-7) obtiveram as menores CI50. Os testes de interação e intercalação com CT-DNA demonstraram a capacidade desses dois compostos de interagirem e intercalarem com o CT-DNA. O ensaio cometa detectou a fragmentação do DNA e a imunoeletroforese demonstrou o aumento da expressão de ?H2AX após o tratamento das células MCF-7 com IP-Se-05 e IP-Se-06. O ensaio clonogênico e a análise do ciclo celular comprovaram a atividade antiproliferativa desses dois compostos, ocorrendo diminuição estatisticamente significativa no número de colônias e a parada do ciclo celular na fase G2/M de células MCF-7, 66,22% para IP-Se-05 e 57,97% para IP-Se-06. Ainda, ambos compostos causaram diminuição da expressão da ciclina A e da pAkt. O ensaio de morte celular comprovou a morte apoptótica e necrótica das células tratadas com IP-Se-05 e morte apoptótica das células tratadas com IP-Se-06, aumentando a expressão de p53. De maneira geral, IP-Se-06 demonstrou maior atividade citotóxica e antiproliferativa em menor concentração, além de desencadear a indução da morte celular somente por apoptose, maior expressão de p53 e menor expressão da ciclina A, talvez pela presença do grupamento 2-metoxifenil. Por fim, supõe-se que IP-Se-05 e IP-Se-06 intercalem com o DNA, causando sua fragmentação na fase S e aumentando a expressão de ?H2AX. Isto ativa a parada do ciclo celular na fase G2/M, diminuindo a expressão da ciclina A e da pAkt, enquanto aumenta a expressão da p53, o que encaminha as células MCF-7 para morte celular apoptótica. Conclue-se que IP-Se-06 é o mais promissor dentre os onze compostos testados neste trabalho. Ele causou maior efeito citotóxico e antiproliferativo in vitro, provavelmente, pela presença do grupamento 2-metoxifenil em sua estrutura química, o que confere polaridade e eletrofilicidade a este composto, destacando-se dos demais.

Abstract : Imidazo[1,2-a]pyridines and organoselenic compounds display a high antitumor potential against several tumor lines in in vitro and in vivo studies. In this way, their merge into a single molecule might bring promising results. In this study, eleven novel imidazo[1,2-a]pyridines were tested initially for their cytotoxic and antiproliferative potential in vitro. To verify cytotoxic and selective activity of these compounds, the MTT test was performed on a panel of tumor cells lines (MCF-7 e HeLa) and a fibroblast cell line (McCoy). The IC50 was determined for the eleven compounds (0-1000 µM) and used to select the compounds with the lowest concentrations. Molecular assays with visible UV spectrophotometry and fluorescence (propidium iodide) was performed to evaluate the compounds interaction and intercalation (50-250 µM) with CT-DNA (150 µM). Comet test was performed to evaluate DNA fragmentation in MCF-7 cells after a 72h treatment at subtoxic concentration, the IC30. Clonogenic assay and cell cycle analysis was performed to evaluate antiproliferative activity. Cell death (propidium iodide/acridine orange) analysis induced by the compounds were performed in MCF-7 cells after a 72h treatment with the IC30. Immunoelectrophoresis to evaluate the expression of proteins related to DNA damage, cell cycle and apoptosis was performed after a 48h treatment. Compounds IP-Se-05 (IC50 = 26 µM /MCF-7) and IP-Se-06 (IC50 = 12.5 µM /MCF-7) exhibited the lowest IC50. Interaction and CT-DNA intercalation tests demonstrated the ability of these compounds to interact and intercalate with DNA. The comet assay detected DNA fragmentation and immunoelectrophoresis demonstrated increased ?H2AX expression in MCF-7 cells after IP-Se-05 and IP-Se-06 treatments. The clonogenic assay and the analysis of the cell cycle evidenced the antiproliferative activity of these two compounds, as statistically significant decrease in the number of colonies and cell cycle gap in the G2/M phase of MCF-7 cells (66.22% for IP-Se-05 and 57.97% for IP-Se-06) were observed. In addition, decreased expression of cyclin A and pAkt was detected. The cell death analysis demonstrated the apoptotic and necrotic death of cells treated with IP-Se-05 and apoptotic death of cells treated with IP-Se-06, increasing p53 expression. In general, IP-Se-06 demonstrated higher cytotoxic and antiproliferative activity in a lower concentration, in addition to induction of cell death mostlyby apoptosis, higher expression of p53 and lower expression of cyclin A, perhaps linked to the presence of a 2-phenylmethoxy group. Finally, it is assumed that IP-Se-05 and IP-Se-06 intercalate with the DNA, causing its fragmentation and increasing the expression of ?H2AX. This activates cell cycle arrest in the G2/M phase, decreasing expression of cyclin A and pAkt, while increasing the expression of p53, which routes MCF-7 cells to apoptotic cell death. It is concluded that IP-Se-06 is the most promising among the eleven compounds evaluated in this work. It displayed greater cytotoxic and antiproliferative effect in vitro, probably, due to the presence of a 2-methoxyphenyl group in its chemical structure, which confers more polarity and electrophilicity to the compound, when comparing it to the others.