Modelagem do crescimento de Leuconostoc mesenteroides em cultura pura e mista usando PCR quantitativo (qPCR)

Abstract

Bactérias dos gêneros Leuconostoc e Weissella estão no grupo de bactérias ácido lácticas (BAL) que são associadas à deterioração de produtos cárneos embalados a vácuo ou atmosfera modificada e com crescimento sob refrigeração. Estão presentes na microbiota natural desses alimentos e são conhecidas por causar esverdeamento, produção de limo na superfície do produto, perda do vácuo da embalagem, diminuindo a vida útil destes produtos. A utilização da microbiologia preditiva, por meio de modelos matemáticos para estudar o comportamento dessas BAL frente a condições de crescimento variadas, é de fundamental importância para, entre outras finalidades, prever a vida útil dos alimentos em que essas bactérias estejam presentes. Geralmente, para o estudo do crescimento microbiano, são utilizados métodos convencionais de quantificação, como o método de contagem padrão em placas (CPP). Porém, quando se trata da microbiota natural dos alimentos (cultura mista), o emprego de métodos convencionais é limitado, uma vez que não permite a diferenciação entre espécies morfologicamente semelhantes como é o caso das BAL em estudo. O uso de técnicas moleculares como a Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa (qPCR) combinada com a microbiologia preditiva é uma alternativa pois trata-se de uma técnica que permite essa diferenciação. O presente estudo tem como objetivo comparar o método de CPP com a técnica de qPCR combinados com a microbiologia preditiva para modelar o crescimento de Leuconostoc mesenteroides em cultura pura e cultura mista, associada à bactéria Weissella viridescens. O método de CPP foi empregado para quantificar L. mesenteroides em cultura pura, em cinco condições isotérmicas de crescimento (4, 8, 14, 20 e 30 °C). O modelo de Baranyi e Roberts (BAR) foi escolhido para descrever os dados, pois apresentou melhor ajuste, com relação ao modelo de Gompertz modificado (GO). O modelo da raiz quadrada foi selecionado (por apresentar R2 superior a 0,99) para descrever a influência da temperatura sobre o parâmetro primário velocidade máxima específica (µmáx). Foi estabelecido um perfil não isotérmico (8-14-8 °C) com a finalidade de simular as variações de temperatura que normalmente ocorrem na cadeia de frios durante o armazenamento e transporte de produtos refrigerados. O método qPCR foi utilizado para quantificação de L. mesenteroides em cultura pura nas temperaturas isotérmicas de 4, 8, 14, 20 e 30 °C, com valores para os limites de detecção (LOD) de 2,14; 1,97; 1,88; 3,00 e 1,96 respectivamente. Além disso, o método de qPCR mostrou uma boa correlação e concordância com os valores de concentração bacteriana (UFC/mL) encontradas no método de CPP e o modelo de BAR apresentou um bom desempenho para descrever os dados de crescimento em cultura pura de L. mesenteroides, obtidos pelos dois métodos. Na cultura mista de L. mesenteroides e Weissella viridescens, o ensaio se mostrou específico para a quantificação e identificação das BAL, com a formação de um único pico de melting para L. mesenteroides (Tm = 82,08 ± 0,05 °C) e W. viridescens (Tm = 80,92 ± 0,07 °C). O modelo de BAR apresentou um bom ajuste aos dados de crescimento para as cinco temperaturas e para ambos os métodos CPP e qPCR. Verificou-se que a cepa W. viridescens sofreu uma inibição acentuada no crescimento em cultura mista cultivada junto com L. mesenteroides à temperatura ótima de crescimento (30 °C), em caldo MRS. O modelo de BAR foi ajustado aos dados do crescimento individual de cada BAL, em que apresentou bom ajuste para L. mesenteroides, em cultura mista, porém o modelo não obteve um bom desempenho quando ajustado aos dados de W. viridescens em cultura mista, com R2 de 0,9525. Os resultados obtidos nesse trabalham são muito importantes, tendo em vista a relevância dessas BAL na deterioração de produtos cárneos embalados a vácuo e sob refrigeração, logo o emprego de metodologias mais rápidas e de alta sensibilidade na identificação e/ou quantificação é de suma importância.

Abstract : Bacteria of the genus Leuconostoc and Weissella are in the group of lactic acid bacteria (LAB) that are associated with the spoilage of meat products packaged under vacuum or modified atmosphere and growing under refrigeration. They are present in the natural microbiota of these foods and are known to cause greening, slime production on the surface of the product, loss of packaging vacuum, shortening the shelf life of these products. The use of predictive microbiology, through mathematical models to study the behavior of LAB against varied growth conditions, is of fundamental importance for, among other purposes, to predict a useful life of the foods in which these bacteria are present. Generally, for the study of microbial growth, conventional quantification methods, such as the standard plate counting method (CPP), are used. However, when it comes to the natural food microbiota (mixed culture), the use of conventional methods is limited, since it does not allow the differentiation between morphologically similar species such as the LAB under study. The use of molecular techniques such as Quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) combined with predictive microbiology is an alternative because it is the technique that allows this differentiation. The present study aims to compare the CPP method with the qPCR technique combined with the predictive microbiology to model the growth of Leuconostoc mesenteroides in pure culture and mixed culture, associated with the bacterial Weissella viridescens. The CPP method was used to quantify L. mesenteroides in pure culture in five isothermal growing conditions (4, 8, 14, 20 and 30 °C). The Baranyi and Roberts s model (BAR) was chosen to describe the data, since it presented better fit, in relation to the modified Gompertz model (GO). The square root model was selected (for presenting R2 greater than 0.99) to describe the influence of temperature on the primary parameter specific maximum (µmax). A non-isothermal profile (8-14-8 °C) was established to simulate the temperature variations that normally occur in the cold chain during the storage and transport of refrigerated products. The qPCR method was used for quantification of L. mesenteroides in pure culture at isothermal temperatures of 4, 8, 14, 20 and 30 °C, with values for limit of detection (LOD) of 2.14; 1.97; 1.88; 3.00 and 1.96 respectively. In addition, the qPCR method demonstrated a good correlation and concordance with the values of bacterial concentration (CFU / mL) found in the CPP method and the BAR model presented a good performance to describe the growth data in pure culture L. mesenteroides, obtained by both methods. In the mixed culture of L. mesenteroides and Weissella viridescens, the assay proved to be specific for LAB quantification and identification, with the formation of a single melting peak for L. mesenteroides (Tm = 82.08 ± 0.05 °C) and W viridescens (Tm = 80.92 ± 0.07 °C). The BAR model presented a good fit to the growth data for the five temperatures and for both CPP and qPCR methods. W. viridescens strain was strongly inhibited in growth in mixed culture grown with L. mesenteroides at the optimum growth temperature (30 °C) in MRS broth. The BAR model was fitted to the individual growth data of each LAB, in which it presented a good fit for L. mesenteroides in mixed culture, but the model did not perform well when fitted to W. viridescens data in mixed culture, with R2 of 0.9525. The results obtained in this work are very important, considering the relevance of these LAB in the spoilage of meat products packaged under vacuum and under refrigeration, so the use of faster methodologies and high sensitivity in the identification and/or quantification is of paramount importance.