Influência de compostos furânicos em leveduras assimiladoras de pentoses

Abstract

A fermentação eficiente dos açúcares presentes em hidrolisados da biomassa lignocelulósica, principalmente pentoses e hexoses, é um passo primordial para a produção do etanol de segunda geração (etanol 2G). Essa eficiência pode ser afetada pela presença de compostos inibidores que são formados nos processos de pré-tratamento dessa biomassa. Dentre esses compostos estão os compostos furânicos, furfural e o 5-hidroximetilfurfural (HMF), dois aldeídos que, em concentrações elevadas, afetam negativamente as células e consequentemente a produção do etanol 2G. A fim de atenuar tal problemática, a busca por micro-organismos naturalmente capazes de fermentar pentoses e de tolerar tais aldeídos é uma alternativa que vem sendo explorada por diversos grupos de pesquisa. Por outro lado, a construção de linhagens industriais de Saccharomyces cerevisiae, utilizando a engenharia genética, também tem sido uma alternativa para contornar essa problemática. Dessa maneira, o presente trabalho se propôs a realizar a caracterização de leveduras isoladas da microbiota Brasileira, assimiladoras de pentoses, através do crescimento celular em glicose e xilose com concentrações crescentes de furfural e HMF, avaliando também a produção de etanol por tais leveduras. Ademais, foi construída uma linhagem de S. cerevisiae industrial recombinante (EZY-01), fermentadora de xilose, que sobre-expressa o gene YNL134C que codifica uma aldeído redutase, com o intuito de melhorar a tolerância dessa ao furfural. Foram determinadas as cinéticas de crescimento aeróbios, fermentações e co-fermentações em batelada simples, em meios contendo glicose e/ou xilose e presença ou não de furfural. Nossos resultados demonstram que para as 12 cepas de leveduras selvagens avaliadas, concentrações de 0,5 g L-1 de furfural ou HMF já foram suficientes para aumentar a fase lag e/ou inibir o crescimento celular das leveduras, principalmente quando a fonte de carbono foi xilose. Observou-se também que a produção de etanol foi afetada negativamente na presença desses dois compostos furânicos. Notou-se que as cepas de Candida queiroziae e Spathaspora suhii foram as mais tolerantes ao furfural em meios contendo glicose. Já em meios contendo xilose as leveduras que se destacaram como mais tolerantes a este mesmo inibidor foram Sp. brasiliensis, Sp. roraimanensis e Sp. suhii. Estas mesmas espécies foram mais tolerantes à presença de HMF, tanto em glicose como em xilose. Nossos resultados demonstraram que a região promotora do gene YNL134C na cepa de S. cerevisiae industrial recombinante foi modificada com êxito, promovendo um nível de transcrição 100 vezes maior do gene, quando comparada a linhagem parental. Durante o crescimento aeróbio em glicose e presença de furfural a cepa que sobre-expressa o gene YNL134C teve sua fase lag diminuída (de 30 a 17 h) e sua taxa de crescimento específico aumentada (de 0,62 a 0,93 h-1). No entanto, não foi possível observar diferenças quando a fonte de carbono foi xilose. Além disso, nas fermentações e co-fermentações de glicose/xilose, em batelada simples, novamente não foram observadas diferenças entre as linhagens de levedura industriais. Dessa maneira, embora a sobre-expressão do gene YNL134C tenha melhorado a utilização da glicose na presença de furfural, não houve melhora na fermentação de xilose, limitando a utilização dessa estratégia para a produção de etanol de segunda geração.

Abstract : The efficient fermentation of sugars present in the hydrolysates of lignocellulosic biomass, mainly pentoses and hexoses, is a primordial step for second-generation ethanol (2G ethanol) production. This efficiency can be affected by the presence of inhibitory compounds that are formed in the pre-treatment processes of this biomass. Among these, furan compounds, furfural and 5-hydroxymethylfurfural (HMF), are aldehydes that at high concentrations negatively affect the cells. and consequently the production of 2G ethanol. In order to attenuate this problem, search for naturally microorganisms capable of ferment pentoses and tolerate these aldehydes is an alternative that has been explored by several research groups. Otherwise, the construction of industrial Saccharomyces cerevisiae strains, using genetic engineering, has also been an alternative to overcome this problem. Therefore, the present work proposed the characterization of pentose-assimilating yeasts isolated from Brazilian microbiomes, through cell growth in glucose and xylose with increase concentrations of furfural and HMF, and evaluating the production of ethanol by these yeasts. In addition, a recombinant industrial xylose fermenting S. cerevisiae strain was developed (EZY-01), over-expressing the YNL134C gene that encodes for an aldehyde reductase, in order to improve its tolerance to furfural. The kinetics of aerobic growth, batch fermentations and batch co-fermentations of glucose and/or xylose in the presence, or not, of furfural were determined. Our results show that for the 12 wild-type yeasts strains evaluated, concentrations of 0,5 g L-1 of furfural or HMF were already sufficient to increase the lag phase and/or to inhibit yeast cell growth, especially when the carbon source was xylose. It was also observed that ethanol production was adversely affected by the presence of these two furan compounds. We notice that the strains of Candida queiroziae and Spathaspora suhii were more tolerant to furfural with glucose. In xylose the yeasts strains that outstand as more tolerant to this inhibitory compound were Sp. brasiliensis, Sp. roraimanensis, and Sp. suhii. These same yeasts were more tolerant to HMF with either glucose or xylose. Our results demonstrated that the promoter region of the YNL134C gene in the recombinant industrial strain was successfully modified, promoting a 100-fold higher transcription level of the gene, when compared to the parental strain. During aerobic growth in glucose in the presence of furfural, the recombinant strain had a decreased lag-phase (from 30 to 17 h), and its specific growth rate increased (from 0.62 to 0.93 h-1). However, it was not possible to observe differences when the carbon source was xylose. In addition, in batch fermentations and batch glucose/xylose co-fermentations no differences were observed between the industrial yeast strains. Therefore, although the over-expression of the YNL134C gene improved the use of glucose in the presence of furfural, there was no improvement with xylose, limiting the use of this strategy for second-generation ethanol production.