Atividade anti-inflamatória ex-vivo e in-vivo de derivados do p-aminofenol e salicilatos

Abstract

Salicilatos e paracetamol (p-aminofenol) são anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs) e seu uso é amplamente difundido na população em geral. Os efeitos adversos de ambos levam a indústria farmacêutica a buscar novas moléculas a fim de se obter maior segurança, com o menor custo possível. O objetivo do presente trabalho foi investigar o efeito anti-inflamatório de nove compostos derivados de paracetamol e salicilatos em modelos experimentais ex vivo e in vivo. Para os ensaios ex vivo foram utilizados neutrófilos peritoneais de camundongos estimulados com LPS (5 µg/mL) na presença ou ausência dos compostos estudados. Assim avaliamos viabilidade celular após contato dos neutrófilos com os compostos em teste, e na sequência triamos os não tóxicos, quanto sua atividade anti-inflamatória avaliando-se sua ação sobre a produção de NOx e IL-6. Nos ensaios in vivo, utilizou-se o modelo da lesão aguda pulmonar induzida pelo LPS, onde os camundongos foram inflamados com LPS (5 mg/kg) isoladamente, ou após o tratamento com os compostos em estudo. Após a coleta do lavado broncoalveolar, foram realizadas as quantificações de leucócitos totais e exsudato, bem como as determinações das concentrações das citocinas pró-inflamatórias fator necrose tumoral alpha (TNF-a), interferon gama (IFN-?) e interleucina-6 (IL-6) e da citocina anti-inflamatória IL-10 (IL-10). Para análise estatística dos resultados dos experimentos ex vivo utilizou-se o teste de análise de variância ANOVA, complementados pelos pós testes de Tukey ou Dunnet. Para os resultados in vivo utilizou-se o teste de análise de variância ANOVA, complementados pelos pós testes de Tukey ou Neuman-Keuls. Valores de p < 0,05 foram considerados significativos. Analisando o efeito dos derivados do p-aminofenol e salicilatos sobre a viabilidade celular dos neutrófilos (ex vivo) verificamos que nenhum dos nove compostos demonstrou toxicidade celular significativa. Por este motivo, todos foram submetidos à avaliação de sua capacidade em inibir a produção de metabólitos do NOx e concentrações de IL-6. Nesta fase dos experimentos, verificamos que todos os compostos foram eficazes em reduzir a produção de NOx, mas apenas quatro deles (1a1, 2a2, 2a4 e 5a1) foram capazes de reduzir significativamente as concentrações de IL-6. Desta forma, estes compostos foram selecionados para seguir os estudos in vivo. Nesta etapa experimental (in vivo), os quatro compostos apresentaram atividade significativa sobre a migração leucocitária e exsudação, no lavado broncoalveolar. Em relação ao efeito destes compostos sobre as citocinas, verificamos que os compostos 2a2, 2a4 e 5a1 inibiram as concentrações de TNF-a, e apenas o composto 2a2 inibiu o INF-?. Nenhum dos compostos foi eficaz em modificar as concentrações de IL-6 e IL-10. Desta forma, os resultados deste estudo demonstraram que os compostos 2a2, 2a4 e 5a1 possuem atividade anti-inflamatória, no entanto o composto 2a2 pode ser considerado o composto mais ativo devido ao seu efeito estar relacionado à inibição celular, vascular e também sobre duas citocinas pró-inflamatórias chaves na perpetuação do processo inflamatório.

Abstract : Salicylates and paracetamol (p-aminofenol) are nonsteroidal anti-inflammatories and its use widely diffused in general population. The adverse effects of both lead the pharmaceutical industry to seek new molecules in order to obtain greater security, with the lowest possible cost. The objective of the present study was to investigate the anti-inflammatory effect of nine compounds derived from paracetamol and salicylates in experimental models ex vivo and in vivo. For the ex vivo assays, peritoneal neutrophils of LPS-stimulated mice (5 µg / ml) were used in the presence or absence of the compounds studied. Thus, we assessed cell viability after neutrophil contact with the test compounds and in the sequence, we evaluated the non-toxic as well as its anti-inflammatory activity, evaluating its action on NOx and IL-6 production. In the in vivo assays, the LPS-induced acute lung injury model was used in which the mice were either challenged with LPS (5 mg / kg) alone or after treatment with the test compounds.After collection of bronchoalveolar lavage, total leukocyte and exudate measurements were performed, as well as the determinations of the concentrations of proinflammatory cytokines tumor necrosis factor alpha (TNF-a), interferon gamma (IFN-?) and interleukin-6 ( IL-6) and the anti-inflammatory cytokine IL-10 (IL-10).For the statistical analysis of the results of ex vivo experiments, the ANOVA variance analysis test was used, complemented by the Tukey or Dunnet tests. For the in vivo results the ANOVA variance analysis test was used, complemented by the Tukey or Neuman-Keuls tests. Values of p <0.05 were considered significant.analyzing the effect of p-aminophenol derivatives and salicylates on neutrophil cell viability (ex vivo), we found that none of the nine compounds demonstrated significant cellular toxicity. For this reason, all were submitted to the evaluation of their ability to inhibit the production of NOx metabolites and IL-6 concentrations. At this stage of the experiments, we found that all compounds were effective in reducing NOx production, but only four of them (1a1, 2a2, 2a4 and 5a1) were able to significantly reduce IL-6 concentrations.In this way, these compounds were selected to follow in vivo studies. In this experimental batch (in vivo), the four compounds presented significant activity on leukocyte migration and exudation in bronchoalveolar lavage. Concerning the effect of these compounds on cytokines, we found that compounds 2a2, 2a4 and 5a1 inhibited TNF-a concentration, and only compound 2a2 inhibited INF-?.None of the compounds was effective at modifying IL-6 and IL-10 concentrations. Thus, the results of this study demonstrated that the compounds 2a2, 2a4 and 5a1 have anti-inflammatory activity, however the compound 2a2 can be considered the most active compound due to its effect is related to cellular inhibition, vascular and to two cytokines proinflammatory properties in the perpetuation of the inflammatory process.