Isolamento, caracterização e incorporação de fagos polivalentes em esporos bacterianos para uso em controle biológico

Abstract

O controle do crescimento microbiano é um desafio crescente nas mais variadas áreas da engenharia, em especial, em sistemas de tratamento de efluentes e em setores produtivos específicos, onde a presença de determinadas bactérias, traz impactos econômico e ambientalmente negativos. Os bacteriófagos vírus que infectam especificamente bactérias e se replicam em seu interior têm sido utilizados como agentes de controle de crescimento microbiano em diversas áreas. Apesar do interesse renovado pela sua aplicação e importância ecológica, fagos com amplo espectro de hospedeiros ainda têm pouca representatividade nos estudos recentes. Além disso, o escopo das aplicações de fagos tem sido limitado por fatores tais como alta especificidade, resistência bacteriana aos fagos e influência de fatores físico-químicos na viabilidade e infectividade dos fagos. O objetivo deste trabalho foi demonstrar que é possível isolar fagos de amplo espectro de hospedeiros e, através da caracterização destes fagos encontrar elementos para compreender sua polivalência. Além disso, explorou-se a incorporação do genoma dos fagos em esporos de Bacillus subtilis, para aumentar a sobrevivência em ambientes desfavoráveis, finalmente, propôs-se uma abordagem diferenciada para o uso de fagos como ferramentas de biocontrole em sistemas de tratamentos de efluentes. Através de uma adaptação da metodologia de isolamento sequencial por múltiplos hospedeiros, isolou-se dois fagos polivalentes, denominados fNA01 e fNA03, capazes de infectar bactérias Gram-positivas e Gram-negativas com alta eficiência. Os principais parâmetros ligados ao ciclo de vida dos fagos, taxa de adsorção (4,41-18,2×10-10 ml/min para fNA01; 4,13-5,75×10-10 mL/min para fNA03), burst size (100-120 UFP/célula e 90-110 UFP/célula, respectivamente) e período de latência (40 min e 40-50 min, respectivamente), foram determinados para os quatro hospedeiros utilizados no isolamento. Os tipos de receptores bacterianos usados pelo fago fNA01 foram identificados usando células hospedeiras tratadas com periodato ou proteinase, e revelaram ser polissacarídeos para todos os hospedeiros. O fago fNA01 teve seu genoma sequenciado e anotado revelando ser um fago do tipo N4, com um genoma de cerca de 76Kbp e 93ORFs. A análise genômica revelou vários genes com potencial relação com sua ampla gama de hospedeiros, incluindo a presença de três genes codificando RNA polimerase, ao mesmo tempo, forneceu informações sobre suas relações evolutivas com fagos do mesmo gênero infectando uma variedade de bactérias diferentes. Outros dois fagos polivalentes, PBSC1 e PBSC2, após brevemente caracterizados, foram usados para otimizar uma metodologia de incorporação de fagos a esporos de Bacillus subtilis. As condições ótimas para maior eficiência de incorporação dos fagos aos esporos foram encontradas quando os fagos foram introduzidos nos pré-esporos com mais alta taxa de esporulação (10 h de incubação) e MOI 1,0. O tempo de maturação dos esporos de 48 h aumentou tanto o rendimento de esporos quanto a eficiência de incorporação. Comparado com os fagos livres, os fagos protegidos por esporos mostraram uma resistência significativamente maior em relação a altas temperaturas, pH extremo, radiação UVA e presença de íons cobre. Demonstrou-se que a germinação dos esporos pode ser induzida por baixas concentrações de L-alanina ou uma mistura germinativa (L-asparagina, D-glicose, D-frutose e K+) para desencadear a germinação e consequente liberação dos fagos protegidos dentro de 60 a 90 min. Em geral, a resiliência superior de fagos polivalentes protegidos por esporos pode permitir armazenamento dos fagos a longo prazo (não refrigerado) e melhorar a eficiência do tratamento com fagos em condições ambientais adversas. Por fim, propôs-se uma nova abordagem para o uso de fagos no controle microbiano com etapas de isolamento, produção e aplicação que se diferenciam do tratamento convencional.

Abstract : Microbial growth control is a challenging issue in many engineering areas, particularly, wastewater treatment systems and in specific productive sectors, where the presence of certain bacteria has economic and environmental negative impacts. Bacteriophages viruses that specifically infect bacteria and replicate inside have been used as microbial control agents in several areas. Despite renewed interest in its application and ecological importance, phages with broad host range still are poorly investigated in recent studies. In addition, the scope of phage applications has been limited by factors such as high specificity, bacterial resistance to phage and physicochemical factors influence on phage viability and infectivity. The aim of this study was to demonstrate that it is possible to isolate broad host range phages and, through the characterization of these phages, to find elements to understand their polyvalence. In addition, we explored phage genome trapping into Bacillus subtilis spores, to increase their survival in harsh environments. Finally, we proposed a new approach for phage application as biocontrol tools in wastewater treatment systems. By adapting the multi-host sequential isolation methodology, two polyvalent phages, fNA01 and fNA03, were isolated, both of them were able of infect Gram-positive and Gram-negative bacteria with high efficiency. The main parameters related to phage life cycle, adsorption rate (4.41-18.2 × 10-10 ml/min for fNA01, 4.13-5.75 × 10-10 ml/min for fNA03), burst size (100-120 PFU/cell and 90-110 PFU/cell, respectively) and latent time (40 min and 40-50 min respectively) were determined for the four isolation hosts. The bacterial receptors molecules used by phage fNA01 were identified using periodate or proteinase treated host cells, and were found to be polysaccharides for all hosts. Phage fNA01 genome was sequenced and annotated revealing this is a N4 like phage, with a genome of about 76Kbp and 93ORFs. Genomic analysis revealed several genes with potential relationship to their wide host range, including the presence of three genes encoding RNA polymerase, at the same time; it provided information on fNA01 evolutionary relationships with phages of the same genus infecting a variety of different bacteria. Two other polyvalent phages, PBSC1 and PBSC2, after being briefly characterized, were used to optimize a phage incorporation into Bacillus subtilis spores methodology. The optimal conditions for greater efficiency of phages incorporation into the spores were found when the phages were introduced into the pre-spores with the highest sporulation rates (10 h incubation) and MOI 1.0. The spores maturation time of 48 h increased both spore yield and incorporation efficiency. Compared with free phages, spore-protected phages showed significantly higher resistance to high temperatures, extreme pH, UVA radiation and the presence of copper ions. It was showed that spore germination may be induced by low concentrations of L-alanine or a germinant mix (L-asparagine, D-glucose, D-fructose and K+) to trigger germination and release protected phages within 60 to 90 min. In general, polyvalent phage trapped in spores superior resilience can allow long-term (non-refrigerated) phage storage and improve the efficiency of phage treatment under adverse environmental conditions. Finally, a new approach was proposed for the use of phages in microbial control with isolation, production and application steps that differ from conventional treatment.