Avaliação do efeito apoptótico das pirazolinas sintéticas H3TM4 e H3TM6 em células de linhagens de leucemias agudas humanas

Abstract

Segundo a Organização Mundial da Saúde, as neoplasias malignas são uma das principais causas de morte no mundo. No Brasil, as leucemias encontram-se entre os dez tipos de câncer mais frequentes e são consideradas um importante problema de saúde pública. A quimioterapia é a estratégia terapêutica mais utilizada no combate às leucemias, entretanto ela apresenta limitações na sua efetividade em função dos graves efeitos adversos relacionados à toxicidade não seletiva dos quimioterápicos disponíveis e das elevadas taxas de recidiva. Assim, a descoberta de novas moléculas com atividade antitumoral que sejam efetivas e seletivas para as células neoplásicas, bem como a investigação dos seus principais mecanismos de morte celular, tornaram-se grandes desafios para pesquisadores da área de oncologia experimental. Nessa perspectiva, as pirazolinas são compostos heterocíclicos sintéticos que se destacam como uma possível alternativa terapêutica, uma vez que são descritas na literatura por sua grande variedade de atividades biológicas. Considerando o exposto, no presente estudo foi investigada a atividade antileucêmica de seis pirazolinas sintéticas sobre duas linhagens celulares de leucemias agudas humanas K562 e Jurkat. Todas as pirazolinas apresentaram propriedades físico-químicas adequadas para uma boa biodisponibilidade oral, de acordo com as regras de Lipinski e Veber. Os dois novos derivados pirazolínicos mais eficazes, H3TM4 e H3TM6, foram selecionados para experimentos posteriores. Os ensaios de citotoxicidade, determinados pelo método do MTT, demonstraram que ambos os compostos reduziram a viabilidade das células K562 e Jurkat de forma dependente do tempo e da concentração e foram altamente seletivos para células leucêmicas quando comparados a células não neoplásicas. Além disso, H3TM4 e H3TM6 não causaram hemólise significativa em eritrócitos humanos saudáveis. Ainda, os derivados pirazolínicos selecionados bloquearam o ciclo celular das linhagens K562 e Jurkat na fase G0/G1 e diminuíram a expressão do marcador de proliferação celular KI-67. Adicionalmente, a morte celular apoptótica induzida por H3TM4 e H3TM6 foi confirmada por três metodologias distintas (a análise morfológica por microscopia de fluorescência, a marcação com Anexina-V por citometria de fluxo e a fragmentação do DNA). Os resultados sugerem que tanto a apoptose intrínseca quanto a extrínseca estão envolvidas no mecanismo de morte celular induzido pelas pirazolinas selecionadas. As células K562 e Jurkat incubadas com H3TM4 e H3TM6 apresentaram aumento da expressão do receptor Fas, diminuição da proteína antiapoptótica survivina e predominância da proteína pró-apoptótica Bax em relação à proteína antiapoptótica Bcl-2. Esse desequilíbrio resultou na perda do ??m, na liberação de AIF e na ativação de caspase-3. Para finalizar, foi demonstrado que as pirazolinas H3TM4 e H3TM6 são citotóxicas não apenas para linhagens celulares leucêmicas, mas também para células neoplásicas de sangue periférico e medula óssea coletadas de pacientes com diferentes subtipos de leucemias agudas.

Abstract : According to the World Health Organization, malignant neoplasms are one of the leading causes of death worldwide. In Brazil, leukemias are among the ten most frequent types of cancer and are considered as an important public health problem. Chemotherapy is the most used therapeutic strategy against leukemias, but it has its effectiveness limited due to the serious adverse effects related to the non-selectiveness of the available drugs and to the high relapse rates. Thus, the discovery of new molecules with antitumor activity, effective and selective for neoplastic cells, as well as the investigation of their main mechanisms of cell death, has become a great challenge for researchers in the experimental oncology field. In this perspective, pyrazolines are synthetic heterocyclic compounds that stand out as a possible therapeutic alternative, as they are described in the literature for their several biological activities. Considering the above, the present study investigated the antileukemic effect of six synthetic pyrazolines on two human acute leukemia cell lines, K562 and Jurkat. All pyrazolines presented adequate physicochemical properties for a good oral bioavailability, according to the rules of Lipinski and Veber. The two most effective pyrazoline derivatives, H3TM4 and H3TM6, were selected for further experiments. Cytotoxicity assays, determined by the MTT method, demonstrated that both compounds reduced the viability of K562 and Jurkat cells in a time and concentration-dependent manner and were highly selective for leukemic cells when compared to non-neoplastic cells. Furthermore, H3TM4 and H3TM6 did not cause significant hemolysis in healthy human erythrocytes. Still, the selected pyrazoline derivatives blocked the K562 and Jurkat cell cycle in the G0/G1 phase and decreased the expression of cell proliferation marker KI-67. Additionally, the apoptotic cell death induced by H3TM4 and H3TM6 was confirmed by three different methodologies (morphological analysis by fluorescence microscopy, Annexin-V labeling by flow cytometry and DNA fragmentation). The results suggest that both the intrinsic and the extrinsic apoptosis are involved in the mechanism of cell death induced by the selected pyrazolines. K562 and Jurkat cells incubated with H3TM4 and H3TM6 presented an increased FasR expression, a decrease in the anti-apoptotic protein survivin and the predominance of the pro-apoptotic protein Bax in relation to the anti-apoptotic protein Bcl-2. This imbalance resulted in loss of ??m, AIF release and caspase-3 activation. Finally, the results demonstrated that pyrazolines H3TM4 and H3TM6 are cytotoxic not only against leukemic cell lines but also to neoplastic cells from peripheral blood and bone marrow samples collected from patients with different acute leukemia subtypes.