Síntese de compostos potencialmente antitripanossomatídeos e avaliação da relação estrutura-atividade com base em ensaios in vitro, acoplados a estudos in silico

Abstract

Apesar dos impressionantes avanços científicos e tecnológicos nas últimas décadas, um número reduzido de novas entidades químicas foi identificado para combater de forma eficaz a doença de Chagas e as leishmanioses. O objetivo deste trabalho foi identificar novos inibidores da enzima tripanotiona redutase por meio de estratégias clássicas de triagem em bibliotecas de compostos sintéticos, bem como utilizando ferramentas de modelagem molecular. Inicialmente, um conjunto de 42 compostos bis-heterociclos, obtido no grupo de trabalho, estruturalmente similar às neolignanas de origem natural (grandisina e veraguensina), foi avaliado in vitro quanto as atividades tripanocida e leishmanicida. Os resultados obtidos permitiram a identificação de 37 compostos ativos frente ao crescimento parasitário de amastigotas de Trypanosoma cruzi. Não foram observadas atividades leishmanicidas promissoras para esses mesmos compostos. O estudo de relação estrutura-atividade (REA) em relação à atividade tripanocida mostrou que a potência destes compostos está correlacionada com a presença de grupos substituintes volumosos e hidrofóbicos. O derivado 3-(3,4-dimetoxifenil)-5-((4-(4-pentilfenil)-1H-1,2,3-triazol-1-il)metil)isoxazol foi o composto mais ativo desta biblioteca em estudo (CI50 12,2 ?M), apresentando nos ensaios in vitro baixa toxicidade frente a linhagem celular monocítica (THP-1) e potência semelhante ao fármaco de referência benznidazol (CI50 10,2 µM). Os compostos foram avaliados frente à enzima tripanotiona redutase, porém, nenhum apresentou atividade significativa. Em outra abordagem, foram realizados estudos guiados pela modelagem molecular, resultando em três modelos farmacofóricos, os quais foram elaborados e validados teoricamente e experimentalmente. Duas bibliotecas virtuais de compostos, uma formada por compostos contidos in house (laboratório Computer-Aided Molecular Design Group , na Universidade de Innsbruck) e outra biblioteca adquirida comercialmente (SPECS), foram triadas nos modelos e com o auxílio de filtros, como ancoramento molecular e propriedades físico-químicas, resultaram na seleção de 47 compostos potencialmente ativos, dos quais, 17 se mostraram ativos nos ensaios de inibição enzimática da tripanotiona redutase. Os dois compostos mais ativos foram 4-amino-N-(2-((5-bromo-2-((2-fluorobenzil)oxi)benzil)amino)etil)-1,2,5-oxadiazol-3-carboxamida S21 e N-(3-etoxi-4-((1-fenil-1H-tetrazol-5-il)oxi)benzil)-2-(4-fluorofenil)etanamina S33, os quais apresentaram CI50 42,3 µM e CI50 93,3 µM, respectivamente. Esses mesmos compostos também apresentarem ação tripanocida e leishmanicida in vitro e serviram de protótipo para a síntese de duas séries de análogos. Um total de 25 análogos foram sintetizados, caracterizados e avaliados quanto à inibição enzimática frente à tripanotiona redutase, bem como tiveram suas ações tripanocida e leishmanicida avaliadas in vitro. Os compostos da série análoga ao composto S21, compostos carbamatos e acetamidas, apresentaram inibição parasitária para ambos parasitos, porém, os análogos do composto S33, compostos aminas e ésteres, não demostraram resultados promissores. Para os cinco compostos que demostraram maior atividade de inibição enzimática, foram realizados estudos de ancoramento molecular a fim de investigar as interações no sítio da enzima. O composto terc-butil(2-((5-bromo-2-((2-fluorobenzil) oxi)benzil)amino)etil)carbamato (CI50 11,4 µM) demonstrou ser o mais ativo quanto à ação tripanocida. Assim, os resultados obtidos por ambas as estratégias utilizadas contribuíram para a identificação de novos esqueletos químicos considerados promissores para o planejamento de compostos antitripanossomatídeos.

Abstract : Despite the impressive scientific and technological advances in the last decades, only a small number of new chemical substances have been developed to effectively treat Chagas disease and leishmaniasis. The objective of this research was to identify new inhibitors of the trypanothione reductase enzyme by using classical screening strategies in synthetic compound libraries, as well as molecular modeling tools. Initially, a synthetic library of 42 bis-heterocyclic compounds, previously synthesized, with similar structure of natural neolignans (veraguensin and grandisin) was screened for trypanocidal and leishmanicidal activity. The results contributed to identify 37 active compounds against the parasitic growth of Trypanosoma cruzi amastigotes. The compounds did not seem to show promising leishmanicidal activity. The structure-activity relationship study showed that the potency of these compounds correlates with the presence of bulky hydrophobic groups. Derivative 3-(3,4-dimethoxyphenyl)-5-((4-(4-pentylphenyl)-1H-1,2,3-triazol-1-yl)methyl)isoxazole (IC50 12.2?M) was the most active compound of this library, showing, in vitro, low toxicity against THP-1 cells line and potency similar to benznidazole (IC50 10.2 µM). The compounds were evaluated for their ability to inhibit T. cruzi trypanothione reductase. None compound showed significant inhibition. Trypanothione reductase inhibition was not identified as the mechanism of action responsible for the trypanocidal activity. In addition, guided by molecular modeling studies, three pharmacophoric models were created, and theoretically and experimentally validated. Two virtual libraries (one comprised compounds available in house Computer-Aided Molecular Design Group Laboratory, University of Innsbruck) and another commercially acquired library (SPECS); were screened in the models with the aid of filters, such as molecular docking and physicochemical properties, resulting in the selection of 47 hits. The compounds were evaluated for enzymatic inhibition of trypanothione reductase and 17 compounds demonstrated to be active. Compounds 4-amino-N-(2-((5-bromo-2-((2-fluorobenzyl)oxy)benzyl)amino)ethyl)-1,2,5-oxadiazole-3-carboxamide S21 and N-(3-ethoxy-4-((1-phenyl-1H-tetrazol-5-yl)oxy)benzyl)-2-(4-fluorophenyl)ethanamine S33 showed CI50 42.3 µM and CI50 93.3 µM, respectively. The two compounds showed in vitro trypanocidal and leishmanicidal activity and they were selected as prototypes for the synthesis of two series of analogues. A total of 25 analogues were synthesized, characterized and evaluated for enzymatic inhibition of trypanothione reductase. Five compounds demonstrated promising activity as inhibitors of the trypanothione reductase enzyme and interactions with the biding site were established by molecular docking. The 25 analogues had their trypanocidal and leishmanicidal actions evaluated. Compounds of the series analogous to compound S21, carbamate and acetamides, showed some degree of activity in both parasites, however, analogues of compound S33 did not show promising results. The compound tert-butyl (2-((5-bromo-2-((2-fluorobenzyl)oxy)benzyl)amino)ethyl)carbamate 94 (IC50 11.4 µM) was the most active compound against T. cruzi, with results similar to benznidazole. The results obtained by both strategies for hit identification contributed to find new chemical scaffolds, which can be considered promising to design new anti-trypanosomatid compounds.