Avaliação da expressão de microRNAs no soro de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP)

Abstract

O Câncer de pulmão é uma doença silenciosa e invasiva, com elevada taxa de mortalidade. Malignidade que está associada à exposição ao tabaco e derivados, assim sendo, indivíduos tabagistas têm maior risco em desenvolver a doença quando comparados a não fumantes. Devido à ausência de sintomas iniciais o diagnóstico ocorre geralmente em fases tardias, limitando a abordagem terapêutica e diminuindo as taxas de sobrevida dos pacientes. Neste sentido, torna-se imprescindível a busca por novas ferramentas diagnósticas que possam auxiliar na detecção do câncer de pulmão de células não pequenas (CPCNP), monitorar a evolução da doença, bem como rastrear indivíduos em risco. Os microRNAS (miRNAs) são pequenas sequências de RNA que regulam a expressão de genes, com elevada estabilidade em fluídos biológicos tais como soro, plasma, urina, entre outros. Diversos estudos já demonstraram que a expressão de miRNAs ocorre de forma distinta entre indivíduos saudáveis e doentes, ou seja, podem diferenciar pacientes com CPCNP de indivíduos livres da neoplasia. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar a expressão de miRNAs em amostras de soro de pacientes com CPCNP em relação aos indivíduos controles (fumantes e não fumantes) e selecionar alguns miRNAs como possíveis biomarcadores diagnósticos para esta neoplasia. Sendo assim, o RNA total das amostras foi extraído e por meio da técnica de microarranjo os miRNAs diferencialmente expressos foram identificados. Nesta etapa, foram avaliadas 21 amostras de pacientes com CPCNP e 13 de indivíduos saudáveis não fumantes. Entre os miRNAs alterados nas comparações realizadas (Pacientes com CPCNP fumantes × indivíduos saudáveis não fumantes; Adenocarcinoma × Carcinoma escamoso; Adenocarcinoma estadio inicial × Adenocarcinoma estadio avançado; Pacientes com CPCNP fumantes × indivíduos saudáveis não fumantes) os seguintes foram selecionados para a etapa de validação pela técnica de transcrição reversa reação em cadeia da polimerase quantitativa (RT-qPCR): hsa-miR-16-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-572, hsa-miR-6867-5p, hsa-miR-5006-5p e o hsa-miR-6807-5p. A etapa de validação foi composta por 3 grupos amostrais, pacientes com CPCNP (n = 36), indivíduos saudáveis não fumantes (n = 15) e indivíduos saudáveis fumantes (n = 15). Os resultados mostraram que os níveis séricos dos miRNAs hsa-miR-21-5p (P < 0,0001), hsa-miR-572(P = 0,0004), hsa-miR-5006-5p (P = 0,0006), hsa-miR-6807-5p (P = 0,0002) e o hsa-miR-6867-5p (P = 0,0005) estavam significativamente elevados nos pacientes com CPCNP em relação aos indivíduos saudáveis não fumantes. Na comparação entre os pacientes com CPCNP em relação aos indivíduos fumantes, os níveis de expressão dos seguintes miRNAs estavam significativamente elevados, hsa-miR-20a-5p (P = 0,0277), hsa-miR-21-5p (P < 0,0001), hsa-miR-24-3p (P = 0,0062), hsa-miR-5006-5p (P = 0,0343), hsa-miR-6807-5p (P < 0,0001) e hsa-miR-6867-5p (P < 0,0001). Além disso, por meio da análise da curva ROC a maioria dos miRNAs alterados mostraram boa sensibilidade e especificidade quanto ao poder diagnóstico para o CPCNP. Na comparação entre pacientes com CPCNP e indivíduos saudáveis não fumantes a AUC para os miRNAs hsa-miR-21-5p, hsa-miR-572, hsa-miR-5006-5p, hsa-miR-6807-5p e o hsa-miR-6867-5p foram, respectivamente, 0,887 (sensibilidade: 75%; especificidade: 69%; P < 0,001), 0,843 (sensibilidade: 88%; especificidade: 66%; P < 0,001), 0,811 (sensibilidade: 80%; especificidade: 80%; P < 0,001), 0,385 (sensibilidade: 92%; especificidade: 66%; P < 0,001) e 0,854 (sensibilidade: 80%; especificidade: 72%; P < 0,001). Na comparação entre pacientes com CPCNP e indivíduos saudáveis fumantes a AUC para os miRNAs hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-5006-5p, hsa-miR-6807-5p e hsa-miR-6867-5p foram, respectivamente, 0,699 (sensibilidade: 65%; especificidade: 86%; P = 0,026), 0,851 (sensibilidade: 83%; especificidade: 80%; P < 0,001), 0,749 (sensibilidade: 75%; especificidade: 66%; P = 0,006), 0,691 (sensibilidade: 74%; especificidade: 66%; P = 0,033), 0,957 (sensibilidade: 86%; especificidade: 66%; P < 0,001) e 0,954 (sensibilidade: 94%; especificidade: 91%; P < 0,001). A análise de bioinformática mostrou que a elevada expressão do hsa-miR-5006-5p pode contribuir com a baixa expressão do gene FOXO3 (Forkhead box O3), tornando-se um biomarcador relacionado ao desenvolvimento do câncer de pulmão. A desregulação do hsa-miR-6807-5p pode ser uma indicação da expressão alterada de alguns fatores de transcrição da família ZNF (Zinc finger family), que, por sua vez, pode aumentar a progressão e o desenvolvimento do câncer. Sendo assim, os resultados apresentados neste trabalho sugerem que os sete miRNAs podem ser promissores candidatos a biomarcadores e serem úteis como uma nova estratégia pra auxiliar no diagnóstico do CPCNP, monitorar a progressão da doença e rastrear indivíduos em risco.

Abstract : Lung cancer is a silent and invasive disease, with a high mortality rate. This malignancy is associated with tobacco exposure and its derivatives, therefore, smokers have a higher risk of developing the disease when compared to nonsmokers. Due to the absence of initial symptoms, the diagnosis usually occurs in later stages, limiting the therapeutic approach and decreasing the patients' survival rates. Therefore, it is imperative to search for new diagnostic tools that can help the detection of non-small cell lung cancer (NSCLC), monitor disease progression, and track individuals at risk. MicroRNAs (miRNAs) are small RNA sequences that regulate gene expression, with high stability in biological fluids such as serum, plasma, urine, among others. Several studies have demonstrated that the expression of miRNAs occurs differently between healthy and sick individuals, i.e., they can differentiate patients with NSCLC from free neoplasm individuals. The aim of this study was to evaluate the miRNAs expression in serum samples of patients with NSCLC in relation to control individuals (smokers and nonsmokers) and to select the miRNAs as possible diagnostic biomarkers for the disease. Thus, total RNA of serum samples was extracted and by microarray technique, the differentially expressed miRNAs were identified. Samples from 21 patients with NSCLC and 13 healthy non-smokers were evaluated in this step. Among altered miRNAs in the performed comparisons (NSCLC patients vs healthy non-smokers individuals; Adenocarcinoma vs Squamous cell carcinoma; Adenocarcinoma initial stage vs Adenocarcinoma advanced stage; smoker NSCLC patients vs healthy non-smokers individuals) the following miRNAs were selected for the validation set by the reverse transcription - quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR): hsa-miR-16-5p, hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-572, hsa-miR-6867-5p, hsa-miR-5006-5p e o hsa-miR-6807-5p. The validation set was composed of three serum sample groups, 36 NSCLC cases, 15 healthy non-smokers, and 15 healthy smokers.The results showed that serum levels of miRNAs hsa-miR-21-5p (P < 0,0001), hsa-miR-572(P = 0.0004), hsa-miR-5006-5p (P = 0.0006), hsa-miR-6807-5p (P = 0.0002) e o hsa-miR-6867-5p (P = 0.0005) were significantly high in NSCLC patients in relation to healthy non-smokers individuals. In the comparison between NSCLC patients and healthy smokers individuals, the expression levels of the following miRNAs were significantly high hsa-miR-20a-5p (P = 0.0277), hsa-miR-21-5p (P < 0.0001), hsa-miR-24-3p (P = 0.0062), hsa-miR-5006-5p (P = 0.0343), hsa-miR-6807-5p (P < 0.0001), and hsa-miR-6867-5p (P < 0.0001). Besides that, by ROC curve analysis, the most of altered miRNAs showed a great sensitivity and specificity in relation to NSCLC diagnostic. In the comparison between NSCLC patients and healthy non-smokers individuals the AUC for miRNAS hsa-miR-21-5p, hsa-miR-572, hsa-miR-5006-5p, hsa-miR-6807-5p e o hsa-miR-6867-5p were, respectively, 0.887 (sensibility: 75%; specificity: 69%; P < 0.001), 0.843 (sensibility: 88%; specificity: 66%; P < 0.001), 0.811 (sensibility: 80%; specificity: 80%; P < 0.001), 0.835 (sensibility: 92%; specificity: 66%; P < 0.001), and 0.854 (sensibility: 80%; specificity: 72%; P < 0.001). In the comparison between NSCLC patients and healthy smokers individuals the AUC for the miRNAs hsa-miR-20a-5p, hsa-miR-21-5p, hsa-miR-24-3p, hsa-miR-5006-5p, hsa-miR-6807-5p, and hsa-miR-6867-5p were, respectively, 0.699 (sensibility: 65%; specificity: 86%; P = 0.026), 0.851 (sensibility: 83%; specificity: 80%; P < 0.001), 0.749 (sensibility: 75%; specificity: 66%; P = 0.006), 0.691 (sensibility: 74%; specificity: 66%; P = 0.033), 0.957 (sensibilility: 86%; especificity: 66%; P < 0.001), and 0.954 (sensibilility: 94%; especificity: 91%; P < 0.001). The bioinformatic analysis showed that the high expression level of hsa-miR-5006-5p may contribute for the down-regulation of FOXO3 gene, becoming an early biomarker of cancer development. The deregulation of hsa-miR-6807-5p may be an indication of altered expression of some transcription factors like ZNF family, which in turn may increase the progression and development of cancer. Thus, the results presented in this study suggest that these seven altered miRNAs might be promising biomarkers for auxiliary diagnosis of NSCLC, monitor disease progression, and track individuals at risk.