Expressão de microRNAs circulantes em pacientes com insuficiência hepática crônica agudizada e experimentação molecular para avaliação funcional dos microRNAs

Abstract

A insuficiência hepática crônica agudizada (do inglês: acute-on-chronic liver failure, ACLF) é uma complicação da cirrose e está associada à falência de um ou mais órgãos e alta mortalidade em curto prazo. Apesar da doença de base ser irreversível, pacientes ACLF possuem potencial de reversibilidade da deterioração aguda da cirrose e recuperação para o estado prévio, antes de um evento de agudização. Sendo assim, o acompanhamento de pacientes com cirrose com a detecção de biomarcadores, tais como os microRNAs (miRNAs), podem auxiliar na prevenção de ACLF e no prognóstico destes pacientes. Os miRNAs são pequenas moléculas de RNA não codificantes, estáveis nos fluidos biológicos, e a diferença nos níveis de expressão pode indicar a presença ou ausência de determinada doença. Além disso, para o entendimento da função dos miRNAs é importante conhecer os respectivos genes-alvo. A identificação pode ser feita por meio da predição computacional de alvos ou experimentação molecular. Diante deste panorama, os objetivos deste trabalho foram avaliar a expressão de miRNAs em amostras de soro de pacientes ACLF e selecionar possíveis biomarcadores de diagnóstico e prognóstico. Além de validar a regulação pós-transcricional mediada por um miRNA de um gene selecionado a partir da predição computacional. Para isso, o RNA total das amostras de soro de pacientes hospitalizados no Hospital Universitário da Universidade Federal de Santa Catariana (HU-UFSC) por descompensação aguda da cirrose foi extraído e os miRNAs diferencialmente expressos foram detectados pela técnica de microarranjo. Os resultados mostraram diferentes miRNAs com expressão alterada nas amostras dos pacientes ACLF bem como naqueles que foram a óbito. Os principais miRNAs significativamente alterados para estas amostras foram: let-7a-5p, let-7g-5p, miR-106b-5p, miR-107, miR-126-3p, miR-17-5p, miR-20a-5p, miR-25-3p, miR-451a, miR-15b-5p, miR-199a-3p, miR-223-3p, miR-575, miR-1202 e miR-5100. Entre esses os miRNAs miR-106b-5p, miR-126-3p, miR-20a-5p, miR-25-3p; miR-451a; miR-223-3p; miR-575; miR-1202 e miR-5100 foram selecionados para validação por transcrição reversa seguido de reação em cadeia da polimerase (RT-qPCR). Na etapa de validação foram incluídas amostras de 139 pacientes. Destes, 35 pacientes (25%) apresentavam ACLF e 31 (22%) evoluíram para óbito em 30 dias. Verificou-se que o miR-223-3p e o miR-25-3p estavam significativamente alterados nos pacientes com ALCF (p=0,026 e p=0,009, respectivamente) e nos que evoluíram para óbito em 30 dias (p=0,006 e p=0,008, respectivamente). Estes miRNAs correlacionaram-se negativamente com valores de creatinina, pontuação de CLIF-SOFA e somente o miR-25-3p correlacionou-se negativamente com a escala MELD. ACLF na admissão foi associada de forma independente a menores níveis de sódio (OR 0,82; IC95% 0,74 - 0,91; p<0,001), Child-Pugh C (OR 3,48; IC95% 1,34 - 9,01; p=0,010), hepatite C (OR 3,69; IC95% 1,35 - 10,04; p=0,011) e miR-25-3p (OR 0,99; IC95% 0,98 0,99; p=0,040). Neste trabalho também foi realizada análise de regressão univariada de Cox e foi observado que os miRNAs miR-223-3p (HR 0,99; IC95% 0,98 0,99; p= 0,030) e miR-25-3p (HR 0,99; IC95% 0,98 0,99; p= 0,013) foram associados a menor sobrevida em 30 dias. Os demais miRNAs estudados não foram associados à presença de ACLF e a um prognóstico desfavorável. Na análise de regressão múltipla de Cox a mortalidade em 30 dias foi associada de forma independente à presença de ACLF (HR 2,69; IC95% 1,25 5,80; p= 0,012), Child-Pugh C (HR 2,92; IC95% 1,28 6,66; p= 0,011) e menor expressão de miR-25-3p (HR 0,99; IC95% 0,99 1,00; p= 0,044). A probabilidade de sobrevida de Kaplan-Meier em 30 dias foi de 70,1% nos indivíduos com expressão do miR-25-3p <50 e de 87,1% naqueles com expressão =50 (log-rank teste, p=0,012). Conclui-se que em pacientes hospitalizados por descompensação aguda da cirrose, as expressões dos miRNAs miR-223-3p e miR-25-3p associaram-se à presença de ACLF e ao prognóstico. Destes, o miR-25-3p relacionou-se de forma independente à ACLF na admissão e evolução para óbito em 30 dias. Além disso, neste trabalho também foi verificada a regulação da quimiocina pro-inflamatória CCL1 pelo miR-20a-5p. Para isso, a região 3 UTR do gene CCL1 foi clonada no plasmídeo pmirGLO e o miRNA precursor (pre-miR-20a) foi clonado no plasmídeo psiUx. Os plasmídeos com os insertos foram transfectados na linhagem celular de carcinoma cervical (HeLa) e em seguida realizado o ensaio da Luciferase. Foi possível verificar uma redução de aproximadamente 50% na atividade relativa da Luciferase. Sendo assim, foi possível validar a interação do miR-20a-5p com o gene CCL1.

Abstract : Acute-on-chronic liver failure (ACLF) is a complication of cirrhosis and is associated with organs failure and high mortality in the short term. Although the underlying disease is irreversible, ACLF patients have the potential for reversibility of acute deterioration of cirrhosis and recovery to the previous state, prior to the acute event. Thus, there is a need for the monitoring of patients with cirrhosis with the detection of biomarkers, such as microRNAs (miRNAs), which may assist in the prevention and prognosis of ACLF. The miRNAs are small non-coding RNA molecules, stable in biological fluids, and the difference in expression levels may indicate the presence or absence of a particular disease. Furthermore, to understand the function of the miRNAs it is important to know the respective gene targets. The identification can be done through target prediction softwares or molecular experimentation. Therefore, the aim of this study was to evaluate the miRNAs expression in serum samples from ACLF patients and to select possible biomarkers for diagnosis and prognosis, as well as to validate the post-transcriptional regulation mediated by a miRNA of a gene selected by the prediction software. To that end, total RNA of serum samples from patients hospitalized in the Hospital of the Federal University of Santa Catarina by acute decompensation of cirrhosis was extracted and the miRNAs differentially expressed were detected by miRNA microarray. The results showed different miRNAs altered in ACLF patients as well as in the patients who died. The major miRNAs significantly altered for these samples were: let-7a-5p, let-7g-5p, miR-106b-5p, miR-107, miR-126-3p, miR-17-5p, miR- miR-25-3p, miR-451a, miR-15b-5p, miR-199a-3p, miR-223-3p, miR-575, miR-1202 and miR-5100. Among these the miRNAs miR-106b-5p, miR-126-3p, miR-20a-5p, miR-25-3p; miR-451a; miR-223-3p; miR-575; miR-1202 and miR-5100 were selected for validation by reverse transcription followed by polymerase chain reaction (RT-qPCR). At the validation stage, samples from 139 patients were included. Of these, 35 patients (25%) presented ACLF and 31 (22%) died after 30 days. It was found that miR-223-3p and miR-25-3p were significantly altered in ALCF patients (p=0.026 and p=0.009, respectively) and in those who died at 30 days (p=0.006 and p=0.008, respectively). These miRNAs were negatively correlated with creatinine values, CLIF-SOFA score and only miR-25-3p correlated negatively with the MELD scale. ACLF was associated in an independently manner with lower levels of sodium (OR 0.82, CI95% 0.74 - 0.91, p<0.001), Child-Pugh C (OR 3.48, CI95% 1.34 - 9.01, p=0.010), hepatitis C (OR 3.69, CI95% 1.35 - 10.04, p=0.011) and miR-25-3p (OR 0.99, CI95% 0.98 0.99, p=0.040). In this work, the univariate Cox regression analysis was performed, and it was observed that miRNAs miR-223-3p (HR 0.99, IC95% 0.98 - 0.99, p=0.030) and miR-25-3p (HR 0.99, CI95% 0.98 - 0.99, p=0.013) were associated with the lowest survival in 30 days. The remaining miRNAs studied were not associated to the presence of ACLF or prognosis. In the multiple Cox regression analysis, 30-day mortality was independently associated with the presence of ACLF (HR 2.69, CI95% 1.25 - 5.80, p=0.012), Child-Pugh C (HR 2.92, CI95% 1.28 - 6.66, p=0.011) and lower expression of miR-25-3p (HR 0.99, CI95% 0.99-1.00, p=0.044). The Kaplan-Meier survival rate after 30 days was 70.1% in individuals with miR-25-3p <50 and 87.1% in those with =50 expression (log-rank test, p=0.012). It was concluded that in patients hospitalized for acute decompensation of cirrhosis, the miR-223-3p and miR-25-3p were associated with the presence of ACLF and the prognosis. Of these, miR-25-3p was independently related to ACLF at admission and evolution to death within 30 days. Moreover, in this work the regulation of the pro-inflammatory cytokine CCL1 by miR-20a-5p was also verified. For this, the 3'UTR region of the CCL1 gene was cloned into the plasmid pmirGLO and the precursor miRNA (pre-miR-20a) was cloned into the plasmid psiUx. Plasmids with the inserts were transfected into the cervical carcinoma cell line (HeLa) and then performed the Luciferase assay. A relative reduction of approximately 50% in relative Luciferase activity was observed. Thus, it was possible to validate the interaction of miR-20a-5p with the CCL1 gene.