Extratos de philodendron bipinnatifidum: avaliação de atividades biológicas in vivo e in vitro e encapsulação pela técnica SEDS

Abstract

Muitas das espécies utilizadas na medicina popular ainda não possuem suas atividades biológicas comprovadas por estudos científicos. Entre estas espécies, a Philodendron bipinnatifidum Schott ex Endl (Araceae), que é nativa da América do Sul, merece atenção especial, pois é usada na medicina popular para tratamento de casos de infecções, como erisipela, e inflamações, como orquites e úlceras e também para o tratamento de reumatismo. Nesse contexto, o objetivo desse trabalho foi a obtenção de extratos de P. bipinnatifidum e avaliação de atividades biológicas in vitro e in vivo, bem como realizar o encapsulamento do extrato de acetato de etila através da técnica SEDS. As atividades antioxidante, antimicrobiana, antinociceptiva e anti-inflamatória de extratos dos talos de P. bipinnatifidum, obtidos através de maceração com solventes orgânicos, foram avaliadas. Alta atividade antimicrobiana foi observada para o microrganismo Streptococcus pyogenes com o extrato obtido a partir do solvente acetato de etila, com MIC 3,20 mg·mL-1 e baixa atividade para o extrato etanólico (10,0 mg·mL-1). Baixa atividade antimicrobiana foi observada para os microrganismos Enterococcus faecalis e Listeria monocytogenes para o extrato de acetato de etila, com MIC de 10,0 mg·mL-1, e não huve atividade para o extrato etanólico. Ambos os extratos resultaram em elevada atividade antioxidante, mas o extrato de acetato de etila apresentou resultados significativamente maiores, com IC50 de 27,11 µg·mL-1, quando registrado 59,43 µg·mL-1 para o extrato etanólico. A atividade biológica mais significativa da fração extraída com acetato de etila está relacionada à composição química deste, em comparação com a fração de etanol, que apresentou a maior concentração de compostos bioativos, como flavonoides quercetina, luteolina, apigenina e rutina. O extrato acetato de etila também apresentou maior concentração dos compostos da classe dos fitoesteróis, como o ß-sitosterol, estigmasterol e campesterol. A partir disso, o extrato de acetato de etila foi avaliado quanto a suas ações antinociceptiva e anti-inflamatória em testes in vivo, utilizando camundongos Swiss machos. A atividade antinociceptiva foi avaliada através do teste de indução de contorções abdominais por ácido acético, nas doses de 250, 375 e 500 mg·kg-1 e do teste da formalina, na dose de 500 mg·kg-1. O teste de campo aberto foi realizado para avaliar possíveis alterações na locomoção espontânea dos animais. Também foi avaliada a possível participação do sistema opioide no efeito antinocicpetivo do extrato no teste da formalina, utilizando naloxona. A avaliação da atividade anti-inflamatória foi realizada pelo teste do edema de pata induzido por carragenina na dose de 500 mg·kg-1. Parâmetros de estresse oxidativo, como níveis de TBARS e tióis, bem como atividades de SOD e CAT foram avaliados no sangue e tecido da pata dos animais submetidos ao teste da carragenina. A toxicidade aguda do extrato foi investigada usando a diretriz OECD 423. O tratamento oral com o extrato de acetato de etila inibiu em 46,8 e 53,5% as contorções abdominais dos camundongos nas doses de 375 e 500 mg·kg-1, respectivamente, e reduziu o efeito da formalina na fase de dor neurogênica e também na fase de dor inflamatória a 500 mg·kg-1. O extrato não causou alterações na locomoção espontânea dos animais (teste de campo aberto), mas o número de bolos fecais foi significativamente menor para o grupo da dose mg·kg-1 quando comparado ao grupo veículo. O pré-tratamento com naloxona causou inibição significativa da atividade antinociceptiva induzida pelo extrato no teste da formalina, revelando o possível envolvimento dos receptores opioides. O extrato administrado na dose de 500 mg·kg-1 evitou o edema da pata induzido por carragenina até 6 horas após a administração de carragenina. A avaliação dos níveis de TBARS e tióis, atividades das enzimas SOD e CAT no sangue e no tecido da pata dos animais submetidos ao ensaio de carragenina sugerem que o efeito anti-inflamatório do extrato pode estar ligado à inibição do estresse oxidativo. A administração aguda do extrato na dose de 2000 mg·kg-1 não causou mortalidade, demonstrando baixa toxicidade. A partir desses resultados, o extrato de acetato de etila foi submetido à encapsulação pela técnica de Dispersão de Solução Aumentada por Fluidos Supercríticos (SEDS) com o biopolímero PHBV. Os parâmetros concentração de extrato e temperatura foram avaliados a partir de um planejamento fatorial 22 com ponto central, com pressão constante de 80 bar. Maior eficiência de encapsulamento (89,56%) foi verificada utilizando 20 µg·mL-1 de concentração de extrato (relação 1:1 extrato e PHBV) e temperatura de 35 °C. Nessas condições também foi verificado o menor tamanho médio de partículas, resultando em 0,622 ± 0,232 µm, com coeficiente de variação de 37,34%. Análises cromatográficas demonstraram que o processo provocou pequena alteração na composição química do extrato, mantendo seus principais constituintes, como os fitoesteróis, campesterol, estigmasterol e ß-sitosterol. Para o composto ß-sitosterol, houve aumento em torno de 35% em sua concentração no extrato após o processo de encapsulamento.

Abstract : Many of the species used in folk medicine do not have their biological activities proven by scientific studies so far. Among these species, Philodendron bipinnatifidum Schott ex Endl (Araceae), which is native from South America, deserves special attention as it is used in popular medicine to treat infections cases such as erysipelas, and inflammations such as orchitis and ulcers, and finally for the treatment of rheumatism. In this context, the objective of this work was to obtain extracts of P. bipinnatifidum and evaluate the biological activities in vitro and in vivo, as well as perform the encapsulation of the ethyl acetate extract through the SEDS technique. We evaluated the antioxidant, antimicrobial, antinociceptive and anti-inflammatory activities of P. bipinnatifidum stems extracts obtained by maceration with organic solvents. We observed high antimicrobial activity for the microorganism Streptococcus pyogenes with the extract obtained from the solvent ethyl acetate, with MIC 3.20 mg·mL-1 and low activity for the ethanolic extract (MIC 10.0 mg·mL-1). Low antimicrobial activity was observed in the Enterococcus faecalis and Listeria monocytogenes microorganisms for the extract of ethyl acetate, with MIC of 10.0 mg·mL-1, and no activity for the ethanol extract. Both extracts resulted in high antioxidant activity, but the ethyl acetate extract presented significantly higher results, with IC50 of 27.11 µg·mL-1, when 59.43 µg·mL-1 was recorded for the ethanolic extract. The most significant biological activity of the fraction extracted with ethyl acetate is related to its chemical composition, in comparison to the ethanol fraction, which presented the highest concentration of bioactive compounds, such as flavonoids quercetin, luteolin, apigenin and rutin. The ethyl acetate extract also showed a higher concentration of compounds of the phytosterols class, such as ß-sitosterol, stigmasterol and campesterol. From this, the ethyl acetate extract was evaluated for its antinociceptive and anti-inflammatory actions in in vivo tests using male Swiss mice. We evaluated the antinociceptive activity through the test of induction of abdominal writhing by acetic acid, at doses of 250, 375 and 500 mg·kg-1 and the formalin test at the dose of 500 mg·kg-1. The open field test was performed to evaluate possible changes in the animals' spontaneous locomotion. We also evaluated the possible participation of the opioid system in the antinocicpetive effect of the extract in the formalin test, using naloxone. The evaluation of the anti-inflammatory activity was performed by the paw edema test induced by carrageenan at a dose of 500 mg·kg-1. Oxidative stress parameters, such as levels of TBARS and NPSH, as well as SOD and CAT activities were evaluated in the blood and paw tissue of animals submitted to the carrageenan test. Acute toxicity of the extract was investigated using OECD directive 423. Oral treatment with ethyl acetate extract inhibited 46.8 and 53.5% of abdominal writhing at doses of 375 and 500 mg·kg-1, respectively, and reduced the effect of formalin in the stage of neurogenic pain and also in the stage of inflammatory pain at 500 mg·kg-1. The extract did not cause changes in the animals' spontaneous locomotion (open field test), but the number of fecal cakes was significantly lower for the 500 mg·kg-1 dose group when compared to the vehicle group. Pretreatment with naloxone caused significant inhibition of the antinociceptive activity induced by the extract in the formalin test, revealing the possible involvement of the opioid receptors. The extract administered at a dose of 500 mg·kg-1 prevented carrageenan-induced paw edema up to 6 hours after administration of carrageenan. Assessment of TBARS and NPSH levels, SOD and CAT enzyme activities in blood and paw tissue of animals submitted to the carrageenan assay suggest that the anti-inflammatory effect of the extract may be linked to the inhibition of oxidative stress. Acute administration of the extract at the dose of 2000 mg·kg-1 did not cause mortality, demonstrating low toxicity. From these results, we subjected the ethyl acetate extract to encapsulation by the technique of Solution Enhanced Dispersion by Supercritical Fluids (SEDS) with the PHBV biopolymer. The parameters concentration of extract and temperature were evaluated from a 22 factorial planning with central point, with constant pressure of 80 bar. We verified higher encapsulation efficiency (89.56%) using mg·mL-1 extract concentration (ratio 1:1 extract and PHBV) and a temperature of 35 ° C. Under these conditions, the lowest mean particle size was also observed, resulting in 0.622 ± 0.232 µm, with a variation coefficient of 37.34%. Chromatographic analysis showed that the process caused a small change in the chemical composition of the extract, maintaining its main constituents, such as phytosterols, campesterol, stigmasterol and ß-sitosterol. For ß-sitosterol compound, there was an increase of about 35% in its concentration in the extract after the encapsulation process.