Desenvolvimento de um modelo de biofilme periodontal multiespécie em biorreator com agitação

Abstract

Esforços têm sido destinados ao aprofundamento do conhecimento dos biofilmes orais patogênicos, como forma de permitir o avanço na descoberta de terapias capazes de prevenir sua adesão ou promover sua erradicação, a fim de impulsionar uma melhor qualidade de vida à população. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um modelo de biofilme multiespécie em biorreator com agitação. Discos de dentes bovinos foram adaptados a um biorreator com o cemento da região cervical da raiz exposto a um meio de cultura contendo 31 espécies bacterianas, prevalentes nos casos de periodontite. Após incubação em condições anaeróbias por 3 e 7 dias, os biofilmes formados na superfície do substrato foram coletados para análise. O teste de viabilidade celular, por meio da contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFCs), determinou o número total de microrganismos viáveis presentes no biofilme; a análise por meio de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) permitiu observar a variedade morfológica das células bacterianas e a arquitetura do biofilme; e o teste de Hibridização DNA-DNA (Eletroforese em Gel de Gradiente de Desnaturação DGGE) identificou e quantificou as espécies bacterianas presentes no biofilme. O estudo do crescimento bacteriano, por meio da análise de massa seca e leitura de densidade óptica, também foi realizado. Os dados obtidos foram analisados estatisticamente pelo teste U de Mann-Whitney (a = 5%) e ANOVA One Way considerarando um nível de significância de 5%. Os biofilmes coletados dos segmentos radiculares após 3 dias de cultivo continham 1,1 × 109 (± 3,3 × 108) UFCs por biofilme, sem diferença significativa comparado aos biofilmes coletados após 7 dias, os quais apresentaram 9,2 × 108 (± 1,8 × 108) UFCs por biofilme (p > 0,05). Nas imagens de MEV foram observados biofilmes contendo células bacterianas de morfologia variada recobrindo uniformemente a superfície do cemento, tanto nos segmentos submetidos ao período experimental de 3 dias, como no de 7 dias. Das 31 espécies bacterianas inicialmente inoculadas no biorreator, 29 (93,6%) estavam presentes no biofilme de 3 dias e 24 (77,4%), no de 7 dias. Espécies precursoras da periodontite foram identificadas em ambos os biofilmes. A velocidade específica do crescimento bacteriano foi de 1,76 h-1. Um modelo de biofilme subgengival de 3 e 7 dias de cultivo foi desenvolvido por meio do uso do biorreator com agitação, permitindo reproduzir, in vitro, comunidades microbianas complexas. Este modelo pode vir a ser um método auxiliar na mimetização do biofilme clínico periodontal e permitirá o estudo de novos mecanismos de ação e compostos antibiofilme e antimicrobianos, que possam ser aplicados futuramente no combate à periodontite.

Abstract: Efforts have been made to increase knowledge of pathogenic oral biofilms aiming the discovery of therapies capable of prevent its adhesion or achieving its eradication, and so, promote a better quality of life. The objective of this paper is to develop a multispecies biofilm model using a agitation bioreactor. Bovine tooth discs made from the cementum of the cervical region from the roots were adapted to a bioreactor and exposed to a culture medium containing 31 bacterial species, the ones prevalent in cases of periodontitis. After incubation under anaerobic conditions during 3 and 7 days, the biofilms formed on the surface of the substrate were collected for analysis. The cell viability test, using counts of Colony Forming Units (CFUs), determined the total number of viable microorganisms present in the biofilm; Scanning Electron Microscopy (SEM) analysis allowed us to observe the morphological variety of bacterial cells and the architecture of the biofilm; for the last DNA-DNA Hybridization test (DGGE) identified and quantified the bacterial species present in the biofilm. Also, it was performed a study of bacterial growth, by dry mass analysis and optical density readings. The data were statistically analyzed by the Mann-Whitney U test (a = 5%) and ANOVA One Way considering a level of significance of 5%. The biofilms collected from the root segments after 3 days of culture contained 1.1 × 109 (± 3.3 × 108) CFUs per biofilm, with no significant difference compared to biofilms collected after 7 days, which presented 9.2 × 108 (± 1.8 × 108) CFUs by biofilm (p> 0.05). Scanning Electron Microscopy (SEM) images showed biofilms containing bacterial cells of numerous morphologies covering uniformly the cement surface in both segments submitted to the experimental period of 3 and also 7 days. Of the 31 bacterial species initially inoculated in the bioreactor, 29 (93.6%) were present in the 3-day biofilm and 24 (77.4%) in the 7-day biofilm. Precursor species of periodontitis were identified in both biofilms. The specific rate of bacterial growth was 1,76 h-1. A subgengival biofilm culture model of 3 and 7 days was developed at a agitation bioreactor, allowing to reproduce, in vitro, complex microbial communities. This model may be an auxiliary method to mimic periodontal clinical biofilm and will support studies of new mechanisms of action to combat periodontitis also antibiofilm and antimicrobial compounds.