Bactérias endofíticas associadas à micropropagação de bambu

Abstract

O avanço do uso do bambu em diversos setores socioeconômicos, além da sua importância ambiental, vem estimulado à necessidade de serem desenvolvidos e disponibilizados métodos rápidos e eficazes para sua propagação. Dentre esses métodos inclui o desenvolvimento de protocolos de micropropagação, a fim de suprir a demanda crescente por mudas de boa qualidade. Um dos principais gargalos para o sucesso da micropropagação é a elevada taxa de contaminação por microrganismos. No entanto, estudos preliminares sugerem que esses microrganismos considerados contaminantes podem ser endofíticos e promovem o crescimento vegetativo. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo identificar e avaliar o potencial na promoção do crescimento vegetal de bactérias isoladas dos bambus Dendrocalamus asper, Bambusa oldhamii e Guadua chacoensis, na inoculação de brotações in vitro do abacaxizeiro-Ananas comosus var. Pérola e do bambu Guadua chacoensis. Foram obtidos 32 isolados bacterianos, destes 31 provenientes dos bambus D. asper e B. oldhamii e um de G. chacoensis. Após purificação desses isolados, foi realizada a caracterização fenotípica, a quantificação da produção de ácido indol acético (AIA) e a identificação molecular. Para a padronização da metodologia da inoculação dos isolados realizou-se um ensaio em brotações de abacaxizeiro Ananas comosus var. Pérola. Neste ensaio, os isolados foram selecionados com base na coloração das colônias e inoculados em brotos in vitro de abacaxizeiros var. Pérola (A. comosus (L.) Merr). Avaliou-se o uso dos isolados bacterianos em dois tratamentos: 1) inoculação concomitante a repicagem das brotações e; 2) em brotações com 30 dias em cultivo em meio de cultura Murashige e Skoog (1962) (MS) líquido. Como tratamentos controle, utilizaram-se dois: um com e outro sem o meio de cultura Luria Bertani (LB). As brotações de abacaxizeiro foram cultivadas em meio de cultura MS líquido enriquecido e com a inoculação dos isolados. Após 30 dias da multiplicação, resultou em maior sobrevivência, quando comparados com a inoculação concomitantes a repicagem das brotações, que não sobreviveram. Da mesma forma, o cultivo em meio de cultura com LB (controle) promoveu maior desenvolvimento das brotações em relação ao meio sem LB, isto por estimular as bactérias associadas ao abacaxi, as quais induziram o crescimento da parte aérea das plantas. Entre os 32 isolados bacterianos, três foram selecionados com base na baixa, média e alta produção de AIA. Entre estes o isolado Ba16 com baixa produção (3,00 µg/mL), o isolado Ba03 com média produção (9,03 µg/mL) e o isolado Ba24 com alta produção (15,73 µg/mL). Os três isolados foram então inoculados em culturas in vitro de G. chacoensis, com 15 dias em cultivo em meio MS semi-sólido, 100 µL de cada isolado em cada planta. Após 30 dias da inoculação dos isolados, o experimento foi avaliado por meio de medidas do número e altura dos brotos, número e comprimento de raízes e da taxa de oxidação. Observou-se que o isolado Ba16 apresentou diferença no parâmetro de comprimento de raiz, quando comparados aos demais isolados Ba03 e Ba24, sugerindo o seu uso potencial associado as plantas micropropagadas de G. chacoensis. Posteriormente, o isolado oriundo de G. chacoensis e outros 7 isolados selecionados pela produção de AIA foram identificados por amplificação da sequência parcial do gene 16S RNAr. Por meio da análise do BLASTn, as espécies que apresentaram similaridade com os isolados Ba03, Ba16 e Ba24, foram Serratia marcescens, Bacillus subtilis e Brevibacillus parabrevis, respectivamente. Sendo assim, o uso desses isolados pode ser empregado para melhorar o protocolo de micropropagação do bambu G. chacoensis, utilizando-se do co-cultivo entre plantas e bactérias.

Abstract: The use of bamboo has advanced in diverse socioeconomic sectors, besides its environmental importance. As a consequence, it has been stimulating the need to develop and provide fast and effective methods for its propagation. These methods include the development of micropropagation protocols in order to meet the growing demand for good quality seedlings. The high rate of contamination by microorganisms causes one of the main bottlenecks effect for the success of micropropagation. However, preliminary studies suggest that these microorganisms considered contaminants, may be endophytic and beneficial for promoting vegetative growth. This study aimed to identify and evaluate the potential of plant growth concerning the bacteria isolated from Dendrocalamus asper, Bambusa oldhamii and Guadua chacoensis bamboos applied in vitro shoots inoculation of pineapple-Ananas comosus var. Perola and bamboo Guadua chacoensis. Thirty-two bacterial isolates were obtained, thisty-one of these isolates from the bamboos D. asper and B. oldhamii, and one of them from G. chacoensis. After the purification of these isolates, the phenotypic characterization, quantification of indoleacetic acid production (IAA) and molecular identification were performed as procedure. The inoculation of the isolates was carried out on sprouts of pineapple Ananas comosus var. Perola in order to standardize this methodology. In this assay, the isolates were selected based on colony staining and inoculated in vitro shoots of Perola (A. comosus (L.) Merr) variety. The use of bacterial isolates was evaluated in two treatments: 1) inoculation in concomitance to the shoots transplantation and; 2) in 30-days shoots exposed to liquid Murashige and Skoog (1962) (MS) cell culture medium. As control treatments, one sort was applied in Luria Bertani culture medium (LB); another one was not submitted to this procedure. The pineapple shoots were cultivated in enriched liquid MS cell culture medium with the inoculation of isolates. After 30 days of multiplication, the result was their higher survival in comparison to the isolates inoculation in concomitance to the shoots transplantation. As a matter of fact, these isolates did not survive. Likewise, the cultivation in culture medium with LB (control) promoted greater development of shoots in relation to medium without LB. In addition, the LB medium stimulated the associated bacteria inducing the growth of the aerial part in the plants. Among the 32 bacterial isolates, three were selected based on low, medium and high IAA production. Among them, the isolate Ba16 with low production (3.00 µg / mL), the isolate Ba03 with medium production (9.03 µg / mL) and the isolate 24 with high production (15.73 µg / mL). Then, three isolates were inoculated into in vitro cultures of G. chacoensis with 15 days in semi-solid MS culture medium, 100 µL of each isolate in each plant. After 30 days of inoculation of the isolates, the experiment was evaluated by means of measure regarding the number and the height of the shoot, the number and the root length and the oxidation rate. It was observed the isolate Ba16 showed a significant difference in the root length parameter in comparison to the other isolates Ba03 and Ba24. It suggests its potential use associated with micropropagated plants of G. chacoensis. Subsequently, the isolate from G. chacoensis and other 7 isolates selected for the production of IAA were identified by amplification of the partial sequence of the 16S RNAr gene. Considering the BLASTn analysis, the species that showed similarity to the isolates Ba03, Ba16 and Ba24 were Serratia marcescens, Bacillus subtilis and Brevibacillus parabrevis, respectively. Therefore, the use of these isolates may be used to improve the micropropagation protocol of G. chacoensis bamboo, using co-cultivation between plants and bacteria.