Proteínas tirosina fosfatase: modelos para métodos modernos de mutagênese química pós-traducional - Estudos de ligação ao DNA e atividade de nuclease de um complexo mononuclear de cobalto

Abstract

Existe um interesse significativo no desenvolvimento de complexos metálicos que possam interagir e clivar a molécula de DNA. Isso porque essas moléculas possuem diversas aplicações tanto como quimioterápicos antitumorais, antivirais e antimicrobianos, quanto como ferramentas para a biologia molecular/biotecnologia em aplicações in vitro. Complexos contendo o metal cobalto despertam grande interesse por conta desse metal ser biocompatível, estar presente em diversas nucleases naturais e possuir propriedades redox interessantes. Neste trabalho foi avaliada a interação e a clivagem de DNA por um complexo mononuclear de Co(II) com um ligante quelante pentadentado. Os estudos de clivagem foram avaliados por eletroforese em gel de agarose utilizando o plasmídeo pBSK II como substrato. O complexo apresentou uma significativa atividade de nuclease, sendo capaz de clivar o substrato em baixas concentrações, tempo curto de reação, temperatura amena e pHs neutros e básicos. Os estudos de interação com o DNA plasmidial demonstraram que o complexo interage de forma eletrostática e por ligações ao sulco menor do DNA. Esses modos de interação foram confirmados utilizando-se a técnica de dicroísmo circular com o ácido desoxirribonucleico de timo de bezerro (CT-DNA) como substrato. Também foram realizados estudos de reatividade na presença de ascorbato de sódio, H2O2 e em condições anaeróbicas para obter informações sobre o mecanismo catalítico da metalonuclease. Ao final, foi sugerido um mecanismo misto de clivagem, majoritariamente atrelado à formação de espécies reativas de oxigênio devido a oxirredução Co(II)/Co(III). Nesse trabalho também foram calculadas as constantes cinéticas de clivagem, que foram comparadas com as mesmas constantes para complexos semelhantes da literatura. Por fim, foram realizados ensaios de clivagem direta de oligonucleotídeos em gel de poliacrilamida, em que foram observados fragmentos contendo terminais 3’-fosfato.