Padronização do método RT-PCR em tempo real para investigação da fusão PML-RARa da t(15;17) em pacientes com leucemia promielocítica aguda em tratamento.

Abstract

A leucemia promielocítica aguda (LPA) é um subtipo de leucemia mieloide aguda (LMA) caracterizada pela presença da translocação entre os cromossomos 15 e 17, o que resulta na proteína de fusão PML-RARα. O monitoramento dos transcritos PML-RARα tornou-se um marcador de diagnóstico fundamental e requer métodos cada vez mais sensíveis para o acompanhamento da resposta terapêutica e a detecção precoce de eventuais recidivas nos pacientes em tratamento. Assim, o objetivo deste trabalho foi padronizar a técnica de RT-PCR em tempo real para a avaliação da fusão PML-RARα da t(15;17) e comparar com os resultados obtidos na RT-PCR convencional. Durante a fase de padronização, foi observado que a RT-PCR em tempo real apresentou uma sensibilidade maior em relação a convencional para detecção de concentrações de transcritos igual a 10¹ cópias de PML-RARα bcr1. Quinze amostras de pacientes foram usadas neste estudo, oito de pacientes PML-RARα bcr1 e sete de PML-RARα bcr3. Comparando-se os dois métodos com as amostras de pacientes, a RT-PCR em tempo real detectou o transcrito PML-RARα bcr1 em quatro amostras, enquanto a RT-PCR convencional detectou o transcrito em apenas duas. Dessa forma, a concordância entre os testes foi moderada de acordo com o teste kappa. Também foi analisada a eficiência de duas transcriptases reversas, aquela que já vinha sendo utilizada na rotina da marca Promega e a da Qiagen (teste), e, foi observado que a transcriptase reversa utilizada como teste, apresentou maior eficiência do que aquela usada na rotina para a amplificação dos transcritos. Assim, foi observado que a qualidade da transcrição reversa é importante para a detecção de fusão PML-RARα. Também foi observado que a RT-PCR em tempo real pode ser realizada em amostras extraídas pelo kit de extração de RNA atualmente usado na rotina (Promega) e a transcrição reversa pelo kit teste (Qiagen). Na avaliação dos custos, a RT-PCR convencional apresentou um custo significativamente menor do que a RT-PCR em tempo real. No entanto, o processamento de várias amostras simultaneamente diminui o custo da RT-PCR em tempo real. Nesse contexto, mesmo que o custo RT-PCR em tempo real qualitativa seja maior, esse método é mais sensível que a RT-PCR convencional e, por ser mais efetivo para a detecção precoce de recidivas na LPA, sugere-se o seu uso na rotina laboratorial.

Acute promyelocytic leukemia (APL) is a subtype of acute myeloid leukemia (AML) characterized by the presence of translocation between chromosomes 15 and 17, which results in the PML-RARα fusion protein. The monitoring of PML-RARα transcripts has become a fundamental diagnostic marker and requires increasingly sensitive methods for monitoring therapeutic response and the early detection of possible relapses in patients during the treatment. Therefore, the objective of this work was to standardize the real-time RT-PCR technique for the evaluation of the PML-RARα fusion of t(15;17) and compare it with the results obtained in conventional RT-PCR. During the standardization phase, it was observed that real-time RT-PCR showed a higher sensitivity compared to the conventional one for detecting concentrations of transcripts equal to 10¹ copies of PML-RARα bcr1. Fifteen patient samples were used in this study, eight from PML-RARα bcr1 patients and seven from PML-RARα bcr3. Comparing the two methods with the patient samples, real-time RT-PCR detected the transcript PML-RARα bcr1 in four samples, whereas conventional RT-PCR detected the transcript in only two. Thus, the agreement between tests was moderate according to the kappa test. The efficiency of two reverse transcriptases was also analyzed, the one that had already been used in the routine of the Promega brand and that of the Qiagen (test), and it was observed that the reverse transcriptase used as a test showed greater efficiency than that used in the routine in the amplification of transcripts. Thereby, it was observed that the quality of reverse transcription is important for the detection of PML-RARα fusion. It was also observed that real-time RT-PCR can be performed on samples extracted by the RNA extraction kit currently used in routine (Promega) and reverse transcription by the test kit (Qiagen). When evaluating costs, conventional RT-PCR had a significantly lower cost than the real-time technique. However, if multiple samples were processed simultaneously, this reduces the cost of real-time RT-PCR. In this context, even though the cost of qualitative real-time RT-PCR is higher, this method is more sensitive than conventional RT-PCR and, because it is more effective for the early detection of recurrences in APL, its use in laboratory routine is suggested.