Caracterização de fermentação de a-glicosídeos pela levedura spathaspora arborariae

Abstract

O processo de fabricação de cerveja depende da eficiente fermentação de maltose e maltotriose por leveduras. Para a fermentação desses carboidratos, já foi descrito para Saccharomyce cerevisiae a necessidade de transportar o a-glicosídeo para dentro das células (pelas permeases AGT1, MALx1 ou MPH2/MPH3) onde são hidrolisadas por maltases (MALx2) ou isomaltases (IMA1-IMA5). Esses genes podem fazer parte de cinco loci MAL não ligados que podem também abrigar um regulador MAL (gene MALx3) que ativa a transcrição das proteínas permeases e hidrolíticas. Com a grande expansão desse setor, aumenta-se cada vez mais a demanda por produtos inovadores e de qualidade superior. Dessa forma, a utilização de leveduras não convencionais permite a obtenção de características organolépticas diferenciadas no produto final. No presente trabalho, avaliou-se o consumo de a-glicosídeos e a produção de etanol pela levedura Spathaspora arborariae UFMG-HM19.1AT, isolada de madeira em decomposição no Brasil, visando identificar genes de interesse para aplicação em outras linhagens assim como a aplicação da própria Sp. arborariae no processo de produção de cerveja. Ensaios de crescimento em condições microaeróbicas em meio YNB + 2% de cada carboidrato revelaram que a Sp. arborariae foi capaz de assimilar maltose (µmáx=0,19 h-1), maltotriose (µmáx=0,26 h-1), sacarose (µmáx=0,26 h-1), trealose (µmáx=0,1 h-1), a-metil glicosídeo (µmáx=0,07 h-1) e rafinose (µmáx=0,08 h-1), e fermentar maltose (1,65 g/L), maltotriose (3,59 g/L), sacarose (3,01 g/L), a-metil glicosídeo (2,81 g/L) e trealose (2,86 g/L). O cultivo em frascos de 250 mL com 50 mL de meio YP + 2% dos carboidratos sob condições aeróbias e 160 rpm de agitação revelou que nessas condições a levedura consegue fermentar maltose (3,27 g/L), maltotriose (2,24 g/L) e sacarose (0,85 g/L). Os ensaios enzimáticos mostraram que células cultivadas em meio YP + 2% de maltose, a-metil glicosídeo ou sacarose mostraram capacidade de hidrolise para maltose, maltotriose, dentre outros a-glicosídeos indicando a presença de possíveis a-glicosidases. Ferramentas de bioinformática (BLASTp, ExPASy, TMpred e MEGA7) foram usadas para identificar uma suposta permease (ORF T1, com 44% de homologia com a permease MAL31) com o motivo PESP e as doze regiões transmembranas características, conservadas na maioria dos transportadores de carboidrato. Uma sequência que codifica uma a-glicosidase putativa (ORF M1, com 50% de homologia com a isomaltase IMA1) foi encontrada próxima a T1, e a região intergênica de 1,8 Kb possui duas caixas TATA, duas caixas GC e três sitios de ligação para o regulador MAL, como descrito na literatura para S. cerevisiae. Paralelamente a isso, foi testada a aplicabilidade da Sp. arborariae no processo de produção de cerveja. Testes preliminares mostram a aplicabilidade dessa linhagem para a produção de cervejas de baixo até alto teor alcoólico. Essa linhagem apresentou desempenho satisfatório com relação à produção de H2S e capacidade de floculação. Ensaios preliminares indiciam sensibilidade dessa linhagem ao fator Killer K4. Analisados em conjunto, os resultados obtidos nesse trabalho sugerem a aplicação da S. arborariae no processo de produção de cervejas. Entretanto mais estudos se fazem necessários com relação aos critérios de segurança e aplicação dessa espécie em processos alimentícios.

Abstract: The brewing process depends on the efficient fermentation of maltose and maltotriose by yeast. For the fermentation of these carbohydrates, it has been described for Saccharomyces cerevisiae the needed to transport the a-glucoside into the cells (by the permeases AGT1, MALx1 or MPH2/MPH3) where they are hydrolyzed by maltases (MALx2) or isomaltases (IMA1-IMA5). These genes may form part of five non-bound loci MAL that may also harbor an MAL regulator (MALx3 gene) that activates the transcription of permeases and hydrolytics. With the great expansion of this sector, the demand for innovative products of superior quality is increasing. Thus, the use of non-conventional yeasts allows the obtaining of differentiated organoleptic characteristics in the final product..In the present work, the consumption of a-glucosides and the ethanol production by the yeast Spathaspora arborariae UFMG-HM19.1AT, isolated from decomposing wood in Brazil, was evaluated in order to identify genes of interest for application in other strains as well as the application of Sp. arborariae itself in the beer production process. Growth assays in microaerobic conditions in YNB medium + 2% of each carbohydrate revealed that Sp. Arborariae was able to assimilate maltose (µmáx=0,19 h-1), maltotriose (µmáx=0,26 h-1), sucrose (µmáx=0,26 h-1), trehalose (µmáx=0,1 h-1), a-methyl-glucoside (µmáx=0,07 h-1) and raffinose (µmáx=0,08 h-1) and ferment maltose (1,65 g/L), maltotriose (3,59 g/L), sucrose (3,01 g/L), a-methyl-glucoside (2,81 g/L) and trehalose (2,86 g/L). The growth in 250 mL flasks with 50 mL of YP + 2% of each carbohydrates under aerobic conditions and 160 rpm of agitation showed that under these conditions the yeast ferment maltose (3,27 g/L), maltotriose (2,24 g/L) and sucrose (0,85 g/L). The enzymatic assays showed that cells grown in YP + 2% of maltose, a-methyl glycoside or sucrose showed hydrolyzing capacity for maltose, maltotriose, among other a-glucosides indicating the presence of possible a-glucosidases. Bioinformatics tools (BLASTp, ExPASy, TMpred and MEGA7) were used to identify a putative permease (ORF T1, with 44% homology with the MAL31 permease) with the PESP motif and the twelve characteristic transmembrane regions conserved in most carbohydrate transporters. A sequence encoding a putative a-glucosidase (M1 ORF, with 50% homology to IMA1 isomaltase) was found close to T1, and the 1.8 kb intergenic region has two TATA boxes, two GC boxes and three binding sites for the MAL regulator, as described in the literature for S. cerevisiae. Parallel to this, the applicability of Sp. arborariae in the beer production process was tested. Preliminary tests show the applicability of this yeast to the production of beers from low to high alcohol content. This yeast presented satisfactory performance with H2S production and flocculation capacity. Preliminary tests indicate sensitivity of this yeast to the Killer factor K4. Taken together, the results obtained in this work suggest the application of S. arborariae in the beer production process. However, more studies are needed regarding the safety criteria and application of this species in food processes.