Fisiologia da germinação de sementes de Trichocline catharinensis Cabrera

Abstract

O aprimoramento do conhecimento fisiológico sobre qualidade e controle da germinação de sementes é uma maneira eficaz de contribuir para o uso e conservação de espécies nativas com valor ecológico e econômico, como a Trichocline catharinensis Cabrera, uma Asteraceae endêmica dos Campos de altitude do sul do Brasil. Esse estudo teve por objetivo caracterizar a fisiologia da germinação de sementes de T. catharinensis, sob a influência dos hormônios GA3 e ABA. Para tanto foi investigado os efeitos das soluções de giberelina (GA3), ácido abscisíco (ABA) e seus inibidores, paclobutrazol (PAC) e fluridone (FLU) na germinação e sua relação com poliaminas (PAs) e enzimas antioxidantes (SOD, CAT, APX, GR). Também, foram caracterizadas as mudanças estruturais e no ciclo celular antes da protrusão radicular, associado a isso as variações na metilação global do DNA. Ainda, analisamos as alterações celulares e a abundância proteica diferencial em resposta ao GA3 e ABA, PAC e FLU na fase II da germinação. Os resultados mostraram que FLU e GA3 promovem aumento na velocidade de germinação, assim como alta porcentagem de germinação ao contrário do ABA que apresentou atraso no início da germinação, e também baixa porcentagem de germinação (58,75%). O tratamento com PAC inibiu a germinação das sementes (7,5%). O efeito estimulante de GA3 e FLU favoreceu o equilíbrio de putrescina (PUT) e espermidina (SPD) sobre espermina (SPM). O balanço de PAs (alta razão (PUT + SPD / SPM)) com as enzimas SOD, CAT e APX medeiam a germinação de T. catharinensis, uma vez que estas biomoléculas mostraram um padrão de acumulação oposto em baixa porcentagem de germinação (PAC e ABA) e alta porcentagem (FLU, GA3 e H2O). Aplicação de todas as PAs exógenas (200 µM) promoveram um aumento na atividade oxidativa. Sugere-se que há uma relação direta entre PAs e sistema antioxidante com o mecanismo fisiológico da germinação de sementes. A conclusão da germinação é indicada pelo aparecimento da radícula através do endosperma micropilar e exotesta. O alongamento celular é iniciado pelo aumento da vacuolização nas células do eixo hipocótilo-radicular, quando os vacúolos de armazenamento de proteínas fusionam-se e transformam-se em vacúolos típicos. Antes da conclusão da germinação observamos células com conteúdo de DNA 4C (fase G2 do ciclo celular). Isso relacionou-se com a redução dos níveis de metilação global do DNA (GDM) observada após 72 horas de embebição, quando a replicação do DNA é possivelmente iniciada. Na semente matura observamos a cromatina compactada em regiões elétron-densas (heterocromatina), e durante a germinação descondensada (eucromatina). A análise dos componentes principais (PCA) explicou 84% da variação na expressão das proteínas e revelou classes distintas de proteínas associadas aos efeitos da FLU, GA3, PAC, ABA e H2O. FLU e GA3 estimulam a germinação, observada por intensa atividade celular e mobilização de reservas. Percebe-se que as sementes submetidas ao GA3, recuperam rapidamente a atividade metabólica, em comparação com o H2O. GA3 up-accumulated proteínas associadas ao metabolismo energético, regulação redox, proteólise e sinalização. Com efeito oposto PAC, down-accumulated proteínas, associadas ao metabolismo de energia, proteólise, estrutura celular e biossíntese de proteínas. Isso é confirmado, quando observamos as células com poucas organelas e plasmodesmos, associados à baixa ativação do metabolismo, e nenhuma mobilização de reservas. Além disso, no tratamento com PAC, observou-se poucos espaços intercelulares no eixo hipocótilo-radicular, na qual pode resultar em menor alongamento e crescimento. Interessante, que as sementes embebidas em ABA apresentaram osmotolerância, observada pela retração do plasmalema, assim como a coalescência de vacúolos, cercada de reservas proteicas (PSVs) enquanto os corpos lipídicos estão próximos à membrana celular. O ABA altera a abundância de proteínas relacionadas a sinalização, metabolismo de energia e metabolismo de nucleotídeos. O ABA influencia o alongamento do eixo hipocótilo-radicular, através do achatamento das células. Essas proteínas diferencialmente acumuladas associadas às alterações celulares são críticas para a transição da absorção de água para a protrusão da radícula. Nossos resultados fornecem informações sobre a fisiologia da germinação, a nível celular e bioquímico de uma Asteraceae selvagem do sul do Brasil, com potencialidades para uso como planta ornamental. Isto é importante no desenvolvimento de práticas de conservação ex situ e in situ para sementes, considerando especialmente as espécies silvestres de famílias biodiversas.

Abstract : Improving physiological knowledge on seed germination quality and control is an effective way to contribute to the use and conservation of neglected native species of ecological and economic value, such as the Trichocline catharinensis Cabrera, an endemic Asteraceae from the Southern Highlands Brazil. The objective of this study was to characterize the germination physiology of T. catharinensis, under the influence of the GA3 and ABA hormones. In order to do so, we investigated the effects of gibberellin (GA3), abscisic acid (ABA) and its inhibitors, paclobutrazol (PAC) and fluridone (FLU) on germination and its relationship with polyamines (PAs) and antioxidant enzymes, GR). Also, we characterized the structural and cell cycle changes prior to radicle protrusion, associated with this variation in the global DNA methylation. Also, we analyzed the cellular alterations and the differential protein abundance in response to GA3 and ABA, PAC and FLU in phase II of the germination. The results showed that FLU and GA3 promoted an increase in the germination speed, as well as a high percentage of germination, as opposed to the ABA, which presented a delay at the beginning of germination, and also a low percentage of germination (58.75%). PAC treatment completely inhibited seed germination (7.5%). The stimulatory effect of GA3 and FLU favored the balance of putrescine (PUT) and spermidine (SPD) on spermine (SPM). The balance of PAs (high ratio (PUT + SPD / SPM) with the SOD, CAT and APX enzymes mediate the germination of T. catharinensis, since these biomolecules showed an opposite accumulation pattern in a low percentage of germination (PAC and ABA) and a high percentage (FLU, GA3, and H2O). Application of all exogenous PAs (200 µM) promoted an increase in oxidative activity. It is suggested that there is a direct relationship between PAs and antioxidant system with the physiological mechanism of seed germination. The conclusion of the germination is indicated by the appearance of the radicle through the micropylar endosperm and exotesta. Cellular elongation is initiated by increased vacuolation in the hypocotyl-radicular axis cells when the protein storage vacuoles fuse and turn into typical vacuoles. Before completion of germination, we observed cells with 4C DNA content (G2 phase of the cell cycle). This was related to the reduction of DNA global methylation (GDM) levels observed after 72 hours of imbibition when DNA replication is possibly initiated. In the mature seed, we observed the compact chromatin in electron-dense regions (heterochromatin), and during decondensed germination (euchromatin). The major components analysis (PCA) explained 80% of the variation in protein expression and revealed distinct classes of proteins associated with the effects of FLU, GA3, PAC, ABA, and H2O. FLU and GA3 stimulate germination, observed by intense cellular activity and mobilization of reserves. It is noticed that the seeds submitted to GA3, quickly recovered metabolic activity, compared to the H2O. GA3 up-accumulated proteins associated with energy metabolism, redox regulation, proteolysis, and signaling. With oppositely capped, down-accumulated proteins, associated with energy metabolism, proteolysis, cell structure, and protein biosynthesis. This is confirmed when we observe cells with few organelles and plasmodesmata, associated with low activation of metabolism, and no mobilization of reserves. In addition, in the treatment with PAC, few intercellular spaces were observed in the hypocotyl-radicular axis, in which it can result in smaller elongation and growth. Interestingly, the ABA-imbibed seeds showed osmotolerance, observed by plasmalemma retraction, as well as the coalescence of vacuoles, surrounded by protein reserves (PSVs) while the lipid bodies are close to the cell membrane. ABA alters the abundance of proteins related to signaling, energy metabolism, and nucleotide metabolism. The ABA influences the elongation of the hypocotyl-radicular axis, through the flattening of the cells. These differentially accumulated proteins associated with cell changes are critical for the transition from water absorption to radicle protrusion. Our results provide information on the physiology of germination, at the cellular and biochemical level of a wild Asteraceae from the south of Brazil, with potentialities for use as an ornamental plant. This is important in the development of ex situ and in situ conservation practices for seeds, especially considering the biodiverse wild plant families.